肝母細胞樣細胞的培養方法及其培養物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及肝母細胞樣細胞的培養方法及其培養物，其中，該肝母細胞樣細胞是 在從誘導性多能干細胞（iPS細胞：inducedpluripotentstemcells)或胚胎干細胞巧S 細胞：embiTonicstemcells)等多能干細胞（PSC:plu;ripotentstemcells)向肝細胞分 化誘導的過程中生成。
[0002] 本申請要求通過參照援引于此的日本專利申請特愿2013-080557號的優先權。
【背景技術】
[0003] 所謂的多能干細胞是指具有多分化潛能和自我更新能力的未分化細胞，并且，已 知多能干細胞具有組織損傷后的組織修復能力。因此，多能干細胞在各種疾病的治療用物 質的篩選、再生醫療領域中很有用，其研究日益活躍。多能干細胞中的iPS細胞是通過在成 纖維細胞等體細胞中導入特定的轉錄因子、例如〇CT3/4、SOX2、KLF4、C-MYC等基因，將體細 胞去分化（dedifferentiate)而制成的誘導性多能干細胞。從理論上來說，具有多分化潛 能性（pluripotency)的細胞能夠分化誘導為包括肝臟等在內的所有組織或器官。
[0004] 作為從多能干細胞向肝細胞分化誘導的方法，主要嘗試了形成細胞團塊（擬 胚體）、在培養基中添加體液因子、或者選擇使用適當的細胞外基質（extracellular matrix)、飼養細胞、基質膠等的方法等。但是，有報告稱通過上述方法得到的肝細胞的藥物 代謝酶活性低（非專利文獻1~3)。在從干細胞向成熟肝細胞分化時，需要從干細胞起經 過中內胚層、內胚層細胞、肝母細胞的分化工序。在各個分化工序中，在培養體系中使用激 活素（activin)A、堿性成纖維細胞生長因子化FGF:basicFibroblastGrowthFactor)、 BMP4(bonemo;rphogeneticprotein4:骨形態發生蛋白 4)、FGF-4、視黃酸或者DMSO(二甲 基亞諷）等的體液因子或化合物。另外，有報告稱肝臟發育需要肥X、HNF4a、HNF6、F0XA2 等轉錄因子（非專利文獻4)。 陽0化]關于使用新一代基因治療用載體系統有效地從ES細胞或iPS細胞等干細胞向肝 細胞分化誘導時的基因導入方法已被公開（專利文獻4)。專利文獻4中公開了下述內容， 良P:通過使用腺病毒載體（adenovirusvector)，在ES細胞或iPS細胞等干細胞中導入從 例如肥X基因、HNF4a基因、HNF6基因W及S0X17基因中選擇的任意一種或多種基因，能夠 使干細胞有效地分化誘導為肝細胞。如上所述，針對有效地從ES細胞或iPS細胞等多能干 細胞分化誘導為肝細胞的方法進行了各種研究。
[0006] 關于人多能干細胞的培養，公開了一種包被有人層粘連蛋白a5P1 丫 1 (人層粘 連蛋白511)的E8片段或人層粘連蛋白a36 2y2(人層粘連蛋白322)的E8片段的細胞 培養用基材（專利文獻5)。專利文獻5中公開的是在無飼養層的培養環境下，將多能干細 胞W保持其多分化潛能性的狀態進行培養。但是，在專利文獻5中，雖然已公開了人多能干 細胞的培養，但不存在任何關于肝母細胞樣細胞等組織干細胞、分化誘導中間細胞的培養 細胞的記載，上述細胞培養用基材的應用僅限于未分化的人多能干細胞。
[0007]【現有技術文獻】 陽00引【專利文獻】
[0009] 專利文獻1:日本公報、特開2002-272480號（日本專利、特許第3635462號公報）
[0010] 專利文獻2:日本公報、特開2003-250566號
[0011] 專利文獻3:日本公報、特開2008-136381號 陽01引專利文獻4:國際公開W02011/052504號小冊子
[0013] 專利文獻5:日本公報、特開2011-78370號
[0014]【非專利文獻】
[0015]非專利文獻1出巧atology. 51，297-305巧010]
[0016] 非專利文獻2 :PLoS One. 6,eM228 巧011]
[0017]非專利文獻3出巧atology. 55,1193-203 [2012]
[0018]非專利文獻4 :化1:ure Reviews Genetics. 3,499-512 [2002]
【發明內容】
[0019] 本發明的課題在于提供一種穩定地對從多能干細胞向肝細胞分化誘導的過程中 生成的"肝母細胞樣細胞"進行維持培養的方法。進而，本發明的課題在于提供一種通過上 述培養方法而得到的培養物。
[0020] 為了解決上述課題，本發明人等不斷認真研究后發現，通過使從多能干細胞向肝 細胞分化誘導的過程中生成的肝母細胞樣細胞與層粘連蛋白（laminin)接觸，能夠解決上 述課題，從而完成了本發明。
[0021] 旨P，本發明的技術內容如下。
[0022] 1. 一種肝母細胞樣細胞的培養方法，其特征在于，包括：使從多能干細胞向肝細 胞分化誘導的過程中生成的肝母細胞樣細胞與層粘連蛋白接觸的工序、和在使所述細胞與 層粘連蛋白接觸后，將未粘附在層粘連蛋白上的細胞除去的工序。
[0023] 2.如上述1所述的肝母細胞樣細胞的培養方法，其特征在于，與從多能干細胞向 肝細胞分化誘導的過程中生成的肝母細胞樣細胞接觸的所述層粘連蛋白，是層粘連蛋白同 種型中的、由層粘連蛋白a 2 P 1丫1(層粘連蛋白211)、層粘連蛋白a 4 P 1丫1(層粘連蛋白 411) W及層粘連蛋白511構成的層粘連蛋白亞型W外的其他層粘連蛋白。
[0024] 3.如上述1所述的肝母細胞樣細胞的培養方法，其特征在于，與從多能干細胞向 肝細胞分化誘導的過程中生成的肝母細胞樣細胞接觸的所述層粘連蛋白，是由具有相對于 整合素a66 1的親和性比相對于整合素a36 1的親和性強運一性質的同種型構成的層粘 連蛋白。
[00巧]4.如上述1~3中任一項所述的培養方法，其特征在于，與從多能干細胞向 肝細胞分化誘導的過程中生成的肝母細胞樣細胞接觸的所述層粘連蛋白是層粘連蛋白 a1P1 丫 1 (層粘連蛋白111)的一部分或全部。
[00%] 5.如上述4所述的肝母細胞樣細胞的培養方法，其特征在于，所述層粘連蛋白111 的一部分中至少包含層粘連蛋白111的E8片段。
[0027] 6.如上述1~5中任一項所述的肝母細胞樣細胞的培養方法，其特征在于，所述肝 母細胞樣細胞是源自誘導性多能干細胞和/或提取的胚胎干細胞的肝母細胞樣細胞。
[0028]7.如上述6所述的肝母細胞樣細胞的培養方法，其特征在于，包括W下工序，即：
[0029] 1)將源自誘導性多能干細胞和/或提取的胚胎干細胞的肝母細胞樣細胞，接種至 包被有層粘連蛋白的細胞培養用固相載體上的工序；
[0030] 2)在接種有所述細胞的細胞培養用固相載體上，將未粘附細胞從所述固相載體除 去的工序；
[0031] 3)將在所述工序2)中粘附在所述固相載體上的細胞在層粘連蛋白上進行培養的 工序。
[0032] 8.如上述7所述的肝母細胞樣細胞的培養方法，其特征在于，還包括W下工序， 即：
[0033] 4)將通過上述7所述的工序1)~3)培養得到的肝母細胞樣細胞，從細胞培養用 固相載體上分離，并使其懸浮在培養基中的工序；
[0034] W將懸浮的所述細胞W細胞數為2. 5X102個/cm2~1. 25X 105個/cm2、優選細胞 數為2. 5 X1〇3個/cm 2~2. 5 X10 4個/cm 2、更優選細胞數為2 X1〇4個/cm 2~2. 5 X10 4個/ cm2的狀態接種至包被有層粘連蛋白的細胞培養用固相載體上的工序；
[0035] 6)將在所述工序5)中粘附在所述固相載體上的細胞在層粘連蛋白上進行培養的 工序。
[0036] 9.如上述8所述的肝母細胞樣細胞的培養方法，其特征在于，將上述8所述的工序 4)~6)反復進行至少一次W上。
[0037] 10.如上述7~9中任一項所述的肝母細胞樣細胞的培養方法，其特征在于，在上 述7的工序1)所述的將細胞接種至包被有層粘連蛋白的細胞培養用固相載體上的工序之 前，將源自誘導性多能干細胞和/或提取的胚胎干細胞的肝母細胞樣細胞分散為單細胞， 并且將分散后的肝母細胞樣細胞接種至工序1)的包被有層粘連蛋白的細胞培養用固相載 體上。
[0038] 11. 一種肝母細胞樣細胞的實質上純粹的培養物，其特征在于，所述肝母細胞樣細 胞是相對于層粘連蛋白同種型中的層粘連蛋白111的粘附能力比相對于層粘連蛋白211、 層粘連蛋白411W及層粘連蛋白511的粘附能力強的細胞。
[0039] 12. -種肝母細胞樣細胞的實質上純粹的培養物，其特征在于，細胞表達從ALB、 CK19、CK7、CYP3A7中選擇的任意一種或一種W上的肝母細胞標記物，并且表達整合素a6 和整合素0 1。
[0040] 13.-種肝母細胞樣細胞的實質上純粹的培養物，其是能夠在細胞表面上表達整 合素的肝母細胞樣細胞培養物，其中，所述肝母細胞樣細胞是相比整合素a 36 1而優先表 達整合素a66 1的細胞。
[0041]14.一種實質上純粹的培養物，其特征在于，通過上述1~10中任一項所述的肝母 細胞樣細胞的培養方法而獲得。
[0042]15.-種肝細胞和/或膽管上皮細胞再生用的移植用組合物，其特征在于，所述移 植用組合物作為活性組分而含有上述11~14中任一項所述的培養物。
[0043]16.-種肝母細胞樣細胞培養用基材，其特征在于，包含包被有層粘連蛋白111的 一部分或全部的細胞培養用固相載體。
[0044]17.如上述16所述的肝母細胞樣細胞培養用基材，其特征在于，所述層粘連蛋白 111的一部分中至少包含層粘連蛋白111的E8片段。
[0045] 18. -種從肝母細胞樣細胞向成熟肝細胞和/或膽管上皮細胞分化誘導的分化誘 導預處理方法，其特征在于，包括：使從多能干細胞向肝細胞分化誘導的過程中生成的肝母 細胞樣細胞與層粘連蛋白接觸的工序、和在使所述細胞與層粘連蛋白接觸后，將未粘附在 所述層粘連蛋白上的細胞除去的工序。
[0046] 19.如上述18所述的從肝母細胞樣細胞向成熟肝細胞和/或膽管上皮細胞分化誘 導的分化誘導預處理方法，其特征在于，與從多能干細胞向肝細胞分化誘導的過程中生成 的肝母細胞樣細胞接觸的所述層粘連蛋白，是層粘連蛋白同種型中的、由層粘連蛋白211、 層粘連蛋白411W及層粘連蛋白511構成的層粘連蛋白亞型W外的其他層粘連蛋白。
[0047] 20.如上述18所述的從肝母細胞樣細胞向成熟肝細胞和/或膽管上皮細胞分化誘 導的分化誘導預處理方法，其特征在于，與從多能干細胞向肝細胞分化誘導的過程中生成 的肝母細胞樣細胞接觸的所述層粘連蛋白，是由具有相對于整合素a66 1的親和性比相 對于整合素a36 1的親和性強運一性質的同種型構成的層粘連蛋白。
[0048] 21.如上述18所述的從肝母細胞樣細胞向成熟肝細胞和/或膽管上皮細胞分化誘 導的分化誘導預處理方法，其特征在于，與從多能干細胞向肝細胞分化誘導的過程中生成 的肝母細胞樣細胞接觸的所述層粘連蛋白是層粘連蛋白111的一部分或全部。
[0049] 22.如上述21所述的從肝母細胞樣細胞向成熟肝細胞和/或膽管上皮細胞分化誘 導的分化誘導預處理方法，其特征在于，