用于增強肝細胞功能的細胞培養基的制作方法
【專利說明】用于増強肝細胞功能的細胞培養基
[0001] 相關申請的交叉參考
[0002] 本申請根據35U.S.C. § 119,要求2012年11月28日提交的美國臨時申請系列第 61/730762號的優先權，本文W該申請為基礎并將其全文通過引用結合于此。 柳的]領域
[0004] 本發明設及細胞培養基、特別是用于培養肝細胞化巧atocyte)或肝臟細胞 (livercell)的細胞培養基，及其使用方法。
【背景技術】 陽0化]藥物誘導的肝損傷是從市場召回藥物的主要原因之一，占約30%的從市場召回藥 物。當下，準確地預測藥物誘導的肝損傷仍然是藥物開發的主要挑戰。在被批準用于臨床 試驗之前，通常在各種體外肝臟細胞模型例如原代肝細胞（PHH)和肝臟細胞系中測試備選 藥物的藥物誘導肝損傷。盡管PHH目前用作藥物誘導的肝損傷研究的"黃金標準"，但難W 在體外保持P皿的功能。例如，P皿的一些關鍵肝功能例如I/II期藥物代謝酶活性，在培 養中最初的24-48小時之內降低約50%。此外，供體-與-供體的差異和有限的供應使 P皿不能用于早期藥物毒性研究，例如高通量篩選（HT巧。相對于P皿，肝臟細胞系具有一些 優勢。例如，肝臟細胞系通常可大量供應且傳代培養不受限，易于操控和適于高通量篩選。 但是，肝臟細胞系相對于PHH也有一些不足，例如低得多的藥物代謝酶水平。因為肝細胞 的活力和功能很大程度上取決于它們的培養條件，所W極其需要改善細胞培養基來支持 高功能的肝細胞。
[0006] 在體內，肝細胞的存活、增殖、分化和代謝功能受到各種可溶因子的高度調節。把 肝細胞從肝組織分離之后，就損失了運些可溶因子。分離時，原代肝細胞進入去分化狀態 并逐漸失去其大多數的功能。經過幾十年的研究，已確定和表征了一些維持肝細胞功能的 可溶因子，例如膜島素、肝細胞生長因子、激素等。運些可溶因子通過不同的機制例如信號 轉導路徑、細胞周期控制等調控肝細胞功能。把運些可溶因子添加到細胞培養基顯著改善 了肝細胞的活力和功能。但是，甚至當培養基中存在運些可溶因子時，也不能完全恢復肝細 胞的體內功能。
[0007] 可通過小分子化學物調控培養的原代肝細胞的功能。例如，CYP3A4的表達和功能 可通過蛋白激酶A活化劑增強，但可被蛋白激酶C活化劑抑制。因此，能模仿人類體內可溶 因子調節功能和能增強總體肝細胞功能的任何小分子化學物都有可能被用作細胞培養基 中的組分。雖然已提出蛋白質激酶A(PKA)抑制劑可用于細胞培養基來促進原代人類肝細 胞生長，但沒有關于包含小分子PKA抑制劑W增強肝細胞功能的培養基的報道。
[0008] 已顯示細胞周期蛋白依賴性的激酶抑制劑增強HepG2細胞中包括CYP2B6和 UGT1A1的多種肝酶的表達，但在化冊人類肝胚細胞瘤化巧atoblastoma)細胞中不能增 強（蘇加塔尼（Sugatani)等，《藥物代謝和分布值rugMet油olismandDisposition)》 38:177-186, 2010)，但沒有掲示用作增強總體肝功能的試劑。
【發明內容】
[0009] 其中，本發明描述能增強培養物中細胞總體藥物代謝功能的化合物、組合物和方 法。例如，在含如本文所述的化合物特別是LFM-A13和結構上相關化合物的培養基中培養 肝細胞或肝臟細胞系，可使廣泛多種藥物代謝酶的表達增加。如本文所述，已發現已報道 為有力的布拉通度urton)酪氨酸激酶度TK)抑制劑的LFM-A13在培養的肝細胞中誘導藥 物代謝酶例如細胞色素P450 (CY巧酶的廣泛表達。此外，LFM-A13和結構上相關化合物還 可增強其它肝功能。令人驚訝的是，測試了結構式不相關的BTK抑制劑，但沒有得到類似于 LFM-A13的結果。
[0010] 在本文所述的實施方式中，細胞培養組合物可包括LFM-A13或結構上相關的化合 物。組合物可用來增強培養的肝臟細胞的總體代謝功能，W維持培養的肝臟細胞的肝功 能，或用來使干細胞分化成肝細胞。因此，運種細胞培養組合物可用于培育用于藥物開發 的高功能人類肝臟細胞。恢復或維持較高的藥物代謝功能可得到更好的基于細胞的模型， 從而改善對藥物誘導的肝損傷的預測。
[0011] 本領域的技術人員在結合附圖閱讀W下詳述內容的基礎上，很容易看出本文所述 各種實施方式中的一種或多種實施方式相比于細胞培養組合物和方法的現有方法的優點。
[0012] 附圖簡要說明
[0013] 圖1是條形圖，顯示來氣米特（LE巧、來氣米特代謝物（LFM)和來氣米特代謝物類 似物A13(LMF-A13)相對于對照（僅培養基）對培養的原代人類肝細胞中CYP3A4或CYP1A2 活性的影響。
[0014]圖2是條形圖，顯示來氣米特（LF)、來氣米特代謝物（LFM)和來氣米特代謝物類似 物A13(LMF-A13)相對于對照（僅培養基）對培養的肝臟細胞系化epaRG和康寧（Corning) 肝臟細胞系）中CYP3A4活性的影響。
[0015] 圖3是條形圖，顯示來氣米特代謝物類似物A13(LMF-A13)相對于對照（僅培養 基）對在五種不同肝細胞培養基中培養的原代人類肝細胞中CYP3A4活性的影響。
[0016] 圖4是條形圖，顯示來氣米特（LE巧、來氣米特代謝物（LFM)和來氣米特代謝物 類似物A13(LMF-A13)相對于對照（僅培養基）對培養的原代人類肝細胞中基礎和利福平 (RI巧誘導的CYP3A4活性的影響。 陽017]圖5A-B是圖表，顯示各種濃度的來氣米特代謝物類似物A13 (LMF-A13)對培養的 原代人類肝細胞中基礎和奧美拉挫（omeprazole)誘導的CYP1A2活性（A)和基礎和利福平 (rifampin)誘導的CYP3A4活性度）的影響。
[0018] 圖6是條形圖，顯示來氣米特（LE巧、來氣米特代謝物（LFM)和來氣米特代謝物 類似物A13 (LMF-A13)相對于對照對培養的原代人類肝細胞中各種藥物代謝酶和肝蛋白的 mRNA水平的影響。對于各mRNA，結果根據下述順序提供：對照，LEF，LFM，LFM-A13。
[0019] 圖7是條形圖，顯示來氣米特代謝物類似物A13 (LMF-A13)相對于對照對用于培養 的原代人類肝細胞中各種藥物代謝酶和肝蛋白的mRNA水平的影響。對于各mRNA，結果根據 下述順序提供：對照，LFM-A13。
[0020] 圖8是條形圖，顯示針對布拉通度urton'S)酪氨酸激酶度TK)和類化1〇激酶 1 (PLK2)，PLK3,和PLK4的shRNA對培養的原代人類肝細胞中CYP3A4酶活性的影響。
[0021] 圖9顯示在存在或不存在LFM-A13時從培養的人類胚胎干細胞化ESC)衍生的巧 光染色的肝細胞的圖像。細胞核用4'，6-二脈基-2-苯基嗎I噪二鹽酸鹽值API)染色，其為 干細胞的標志物；白蛋白（ALB)，其為肝前體標志物；多藥物抗性相關蛋白2(MRP2),其為 肝功能標志物。
[0022]圖10是條形圖，顯示LFM-A13對培養的干細胞衍生的肝細胞中的基礎和利福平誘 導的CYPA4活性的影響。
[002引圖11是條形圖，顯示當細胞在含有或不含有Matrigel?覆蓋層（M0L)的膠原被覆 的板（C0L)上培養時，分化成肝細胞或前體的hESC中mRNA表達的實時PCR分析：ALB是白 蛋白，AFP是甲胎蛋白，CYP3A4是細胞色素P4503A4,CYP7A1是細胞色素P4507A1，和PGCla 是過氧化物酶體增殖物活化的受體-丫 -共活化因子-1a。
[0024]發明詳述
[00巧]在W下詳述和實施例中，參照構成說明書的一部分的附圖，附圖中通過示例顯示 幾個具體實驗的示例結果，其顯示本文所述的化合物、組合物和方法的效果。應理解，能夠 設想并做出其它實施方式而不偏離本發明的范圍或精神。因此，W下發明詳述和實施例不 應理解為限制性的。
[00%] 除非另外說明，本文使用的所有科學和技術術語的含義是本領域通用的含義。本 文所提供的定義用于促進理解本文中常用的某些術語，且無意于限制本發明的范圍。
[0027] 在本說明書和權利要求書中所用的單數形式"一個"，"一種"和"該（所述）"包括 具有多個指示物的實施方式，除非上下文中有明顯的表示。
[0028] 除非另有明確說明，如本文的說明書和所附權利要求所使用，術語"或"一般包括 "和/或"的意思。
[0029] 如本文所使用，"干細胞"是能連續的分裂（自我更新），并且能分化成多樣的特化 細胞的細胞。在一些實施方式中，干細胞是能夠從對象的器官或組織分離的多能、全能或多 能性干細胞。運些細胞能夠得到完全分化的或者成熟的細胞種類。干細胞可W是源自骨髓 的干細胞、間充質干細胞（MSC)、類似的或者為神經元干細胞或者胚胎干細胞。干細胞可W 是選自上皮和脂肪組織、廝帶血、肝、腦或其他器官的多譜系細胞。在各種實施方式中，所述 干細胞是多能性干細胞，例如從哺乳動物分離的多能性胚胎干細胞。合適的哺乳動物可W 包括曬齒類動物，例如小鼠或大鼠，靈長類動物，包括人類和人類W外的靈長類動物。
[0030] 已經建立的人胚胎干細胞系的例子包括但不限于化，H7,H9,H13或 化4(可得自威斯康辛大學OJniversityofWisconsin)建立的WiCell)(湯普 森（Thompson) (1998)Science282:1145) ;hESBGN-01，hESBGN-02，hESBGN-03(布 勒薩基因有限公司度resaGen,Inc.)，美國佐治亞州埃瑟（Athens,GA));肥S-1, 肥S-2,肥S-3,肥S-4,肥S-5,肥S-6 (得自新加坡的ES細胞國際有限公司巧SCell International,Inc. ,Singapore));服F-1,服F-6 (得自美國圣弗朗西斯科的加利福尼 亞大學扣DiversityofCalifornia，SanFrancisco))；I3,1 3.2,1 3.3,1 4,1 6,1 6. 2,J3,J3. 2(源自W色列海法的W色列科技研究所（Technion-IsraelInstitute ofTechnology,化ifa,Israel)) ;UCSF-1 和UCSF-2 (吉納己斯夫（Genbacev)等人，費 繩爾（Fertil)