含脂質運載蛋白融合伴侶的制作方法
【專利說明】含脂質運載蛋白融合伴侶
[0001] 關于聯邦資助研究的聲明
[0002] 本發明是在美國政府的支撐下依據國家衛生研究院合同號R01CA13549UNIHR0I AI059543、AI094419 和AI097786 而完成。
[000引發明背景
[0004] 在藥物發現方面的努力繼續使用巨大的技術和財政資源來鑒別和開發新的和適 用的藥物。不幸的是，發現新藥一直是困難的。例如，開發損傷性小（更確切地說祀向癌 癥）的療法是有必要的。但即使研究了數十年，科學家仍在努力鑒別具有醫藥和癌癥祀向 性質的正確混合的治療化合物，其不僅降低了治療化合物可充當治療策略的可能性，而且 對成功的手術切除法產生需要。
[0005] 已經研究了廣泛的多種類型的化合物并且將其從事于眾多治療目的。例如，小的 化學分子和較大生物制劑（例如抗體）已經用于大量治療應用中，取得了不同的成功。也 已經顯示一些較小的膚例如因其天然的效力而適用作藥物。
[0006] 缺少快速并有效地制造用于臨床應用的膚和蛋白質的方法已經限制了可W充當 治療化合物的膚和蛋白質的發現。已經在細菌表達系統（例如大腸桿菌巧.Coli)基因表 達）中探索了產生膚、蛋白質結構域或蛋白質與不同蛋白質的融合物W增強膚和蛋白質的 產生。然而，細菌蛋白表達系統一般因蛋白質折疊效率誤差而受限。因此，仍需要可快速并 有效地產生膚、蛋白質結構域和蛋白質的方法。
[0007] 發明概述
[0008] 本發明設及產生隧鐵蛋白（siderocalin)融合蛋白的方法。在各個方面，本發明 設及根據那些方法產生的融合蛋白。在某些方面，融合蛋白被裂解，從而產生根據本公開的 膚。本發明還設及產生融合蛋白的方法，所述方法包括在細胞中表達融合蛋白，所述融合蛋 白包含膚或蛋白質結構域和脂質運載蛋白，從而產生融合蛋白。在一些實施方案中，本發明 還設及一種產生膚的方法，所述方法包括：在細胞中表達包含膚和脂質運載蛋白的融合蛋 白；W及從脂質運載蛋白分離膚，從而產生膚。
[0009] 在一些實施方案中，本發明設及融合蛋白的組合物，所述組合物包含：膚或蛋白質 結構域；W及脂質運載蛋白。在一些實施方案中，本發明還設及一種包含膚文庫的組合物， 所述膚文庫還包含多種缺乏至少一個天然賴氨酸殘基的膚。本發明還設及一種組合物，其 包含：包含膚和脂質運載蛋白的融合蛋白。
[0010] W引用的方式并入
[0011] 本說明書中提及的所有出版物、專利及專利申請都W引用的方式并入本文中，其 引用程度如同每一個別出版物、專利或專利申請被特定地且個別地表明W引用的方式被并 入一樣。
[0012] 附圖簡述
[0013] 在隨附權利要求書中特別地示出了本發明的新穎特征。將通過參考W下闡述說明 性實施方案（其中利用了本發明的原理）的詳細描述，W及隨附圖式來獲得對本發明的特 征和優勢的更好理解，在所述圖式中：
[0014] 圖1提供了示出根據本發明的一個實施方案的多種支架的凝膠圖像。
[0015] 圖2示出了根據本發明的一個實施方案產生膚文庫的實例方法。
[0016] 圖3描繪了根據本發明的一個實施方案可用W制備打結素（knottin)(例如氣泡 蛋白）的實例融合系統。
[0017] 圖4示出了根據本發明的一個實施方案使用質譜對大的膚文庫的分析。
[0018] 圖5示出了根據本發明的一個實施方案使用隧鐵蛋白融合物W表達打結素變體 的實例方法。
[0019] 圖6描繪了根據本發明的實施方案對表達性打結素支架的SDS-PAGE分析。
[0020] 圖7提供了根據本發明的一個實施方案的匯集文庫產生的示意圖。圖7B示出了 圖7A的透視圖。
[0021] 圖8描述了根據本發明的一個實施方案來自克隆的打結素文庫的代表性測序數 據。
[0022] 圖9示出了根據本發明的實施方案對3000個成員的打結素文庫的SDS-PAGE分 析。
[0023] 圖10示出了根據本公開的一個方面制造打結素的一般過程。
[0024] 圖11示出了根據本公開的一個方面制造打結素的一般過程。
[00巧]圖12示出了根據本公開的一個方面制造打結素的一般過程。根據運個方面，裂解 出現在弗林蛋白酶-打結素交界面。
[0026] 圖13示出了根據本公開的一個方面用代達羅斯系統值aedalussystem)制備的 打結素的實例和相應的SDSPAGE分析。代達羅斯系統描述于BandaranayakeA.化等， NucleicAcidsRes. (2011)39(21) :el43 中。
[0027] 圖14示出了來自18個物種的Sen序列的比對。所述比對示出了在18個具有可 識別的直系同源體的物種之間高水平的序列保守性。星號位置是用于配體結合的可能位 點。Correnti，C.和Strong，R.K. (2013)'Ironsequestrationinimmunity'在Metals inCelIs中;Encvclopedi曰ofInorg曰nic曰ndBioinorg曰nicChemistry. (Culotta，V.和 Scott,R.A.，編.）JohnWiley&Sons，第：M9-59 頁。
[0028] 圖15描繪了根據本公開的一個方面的超穩定Sen的3D模型。在運種形式的Sen 中，將第二個二硫鍵工程化W保護N末端并且提高熱穩定性。
[0029] 圖16示出了可用于本公開的各個方面的一般Sen融合物的示意圖。除去天然信 號膚并且增加外源性sFLAG和HIS標簽W幫助純化。運些修飾任選地存在于本公開的各個 方面。
[0030] 圖17描繪了根據本公開的一個方面輕鏈抗體與Sen的融合物和相應的SDSPAGE 分析的示意圖。
[0031] 圖18示出了根據本公開的一個方面比較Sen與胞質酶HM0X1的融合物的表達在 裂解前后的SDSPAGE分析。
[0032] 圖19描繪了根據本公開的一個方面Sen與細胞質病毒蛋白質Adv2的融合物的表 達W及相應的SDSPAGE分析。
[0033] 圖20描繪了根據本公開的一個方面Sen與細胞外病毒糖蛋白HIV甜120的融合 物的表達W及相應的SDSPAGE分析。
[0034] 圖21描繪了根據本公開的一個方面Sen與打結素蛋白歐前胡素的融合物的表達 W及相應的SDSPAGE分析。
[0035] 圖22描繪了根據本公開的一個方面Sen與細胞外酪氨酸激酶受體R0R1的小的亞 結構域（即=環域）的融合物的表達W及相應的SDSPAGE分析。
[0036] 圖23描繪了根據本公開的一個方面Sen與屯聚體W及=聚體亞結構域的融合物 的表達W及相應的SDSPAGE分析。
[0037] 圖24描繪了根據本公開的一個方面ExFABP與打結素的融合物的表達W及相應 SDSPAGE分析。ExFABP是另一功能性Sen。根據本公開，運種構建體可用于周質細菌系統 W分泌多種客戶蛋白。
[0038] 圖25描繪了具有化配體的Sen的晶體結構。
[0039] 圖26描繪了捕獲的巧光鐵載體。左框描繪了蛋白質鐵載體絡合物的尺寸排阻純 化。右框是不意圖。
[0040] 發明詳述
[0041] 本公開的方法和系統設及融合蛋白和其制造方法。根據某些方面，使用本發明的 方法產生的膚可用作藥物發現平臺的組分。在一些方面，所述方法設及產生具有潛在治療 價值的第一蛋白質或膚與第二蛋白質的融合物，W使第二蛋白質增強表達系統對第一蛋白 質的產生和折疊。在一些方面，在表達和純化融合蛋白之后，融合蛋白裂解，W使第一蛋白 質和第二蛋白質為獨立蛋白質。在一些方面，第二蛋白質可為脂質運載蛋白。例如，第二蛋 白質可為特異性脂質運載蛋白，如隧鐵蛋白。
[0042] 綴合物
[0043] 在一些方面，本發明包括如本文所述的融合蛋白、膚或其綴合物。例如，一些或所 有融合蛋白或膚可綴合于選擇W修飾膚性質的部分。
[0044] 在某些方面，本發明包括在N末端綴合于疏水性（例如親脂性）部分的融合蛋白 或膚。所有或一些本公開的融合蛋白或膚可缺乏內部賴氨酸，例如W避免在內部賴氨酸位 置的綴合，從而允許綴合于膚的氨基端。在一些實施方案中，疏水部分連接于N末端可用W 延長本公開的融合蛋白或膚的半衰期。在一些實施方案中，簡單碳鏈（例如通過肉違酷化 和/或棟桐酷化）可綴合于融合蛋白或膚。在一些方面，簡單碳鏈可使融合蛋白或膚從非 綴合物容易地分離。例如，可用于從非綴合物分離融合蛋白或膚的方法包括但不限于溶劑 萃取和反相色譜法。親脂部分可通過可逆地結合于血清白蛋白來延長半衰期。在某些實施 方案中，也可將近紅外染料連接于融合蛋白或膚的N末端W允許追蹤所綴合的融合蛋白或 膚。在某些實施方案中，也可將近紅外染料連接于膚的賴氨酸W允許追蹤所綴合的膚。染 料的抗體可進一步允許染料填補追蹤標記與收回手柄的雙重作用。綴合的融合蛋白或膚也 可W綴合于可起到其它作用的其它部分，所述其它作用如為從組織或液體收回膚提供親和 手柄（例如生物素）。
[0045] 可使用其它修飾。例如，融合蛋白、膚或其綴合物可包括翻譯后修飾（例如甲基化 和/或酷胺化）。在一些實施方案中，本公開的融合蛋白或膚可綴合于例如可修飾膚或實 現其性質變化的其它部分。綴合部分可為例如通過可逆地結合于血清白蛋白來延長膚半衰 期的親脂部分。在一些實施方案中，親脂部分可為膽固醇或膽固醇衍生物，包括膽醬締、膽 醬燒、膽醬二締和氧固醇（oxysterol)。在一些實施方案中，膚可綴合于肉豆違酸（十四燒 酸）或其衍生物。
[0046] 在一些實施方案中，本公開的融合蛋白或膚可綴合于可檢測標記W可追蹤檢測或 可視化綴合膚的生物分布。可檢測標記可為巧光標記（例如巧光染料）。在某些實施方案 中，巧光標記可具有具體應用所需的發射特征。例如，巧光標記可為最大發射波長在W下范 圍之間的巧光染料：500nm至 1100nm、600nm至 1000nm、600 至 800nm、650nm至 850nm、700nm 至800nm、720至780nm，或720至750nm。例如，在一定條件下，花菁5. 5的最大發射可為約 695nm、IRdye800的最大發射可為約800nm，并且嗎I噪菁綠的最大發射可為約820nm。本領 域的普通技術人員將了解可用作可檢測標記并且具有上述發射特征的各種染料。
[0047] 如本文所用，術語"可檢測標記"意指可連接于小的化學分子、膚、蛋白質或其片段 或部分的標簽或修飾，W使所述小的化學分子、膚、蛋白質或其片段或部分可使用允許檢測 所述標簽或修飾的裝置、設備或方法識別。
[0048] 在一些方面，可檢測標記是巧光染料。可在本公開中用作綴合分子的巧光染料的 非限制性實例包括若丹明、對甲氨基酪、巧光素、硫基巧光素、氨基巧光素、簇基巧光素、氯 巧光素、甲基巧光素、橫基巧光素、氨基對甲氨基酪、簇基對甲氨基酪、氯對甲氨基酪、甲基 對甲氨基酪、橫基對甲氨基酪；氨基若丹明、簇基若丹明、氯若丹明、甲基若丹明、橫基若丹 明和硫基若丹明、花菁、嗎I噪幾花菁、氧雜幾花菁、硫雜幾花菁、部花菁、花菁染料（例如花 菁2、花菁3、花菁3. 5、花菁5、花菁5. 5、花菁7)、嗯二挫衍生物、化晚基嗯挫、硝基苯并嗯 二挫、苯并嗯二挫、巧衍生物、級聯藍、嗯嗦衍生物、尼羅紅（Nilered)、尼羅藍、甲酪紫、嗯 嗦170、叮晚衍生物、原黃素、叮晚澄、叮晚黃、芳基次甲基衍生物、氧雜蔥染料、橫化氧雜蔥 染料、AlexaFluor(例如AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、Alexa Fluor700)、金胺、結晶紫、孔雀綠、四化咯衍生物、化嘟、獻花菁和膽紅素。在一些實施方 案中，染料可為近紅外染料，包括例如切5. 5、IRdye800、DyLi曲t750或嗎I噪菁綠（ICG)。 在一些實施方案中，近紅外染料可包括花菁染料（例如花菁2、花菁3、花菁3. 5、花菁5、花 菁5. 5、花菁7)。在某些實施方案中，可檢測標記可包括氧雜蔥染料或橫化氧雜蔥染料，如 AlexaFluors(例女日AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor 700)。如果可找到染料的抗體，那么可將綴合染料用作追蹤、檢測或可視化標記和收回手 柄。
[0049] 本發明的融合蛋白或膚也可W綴合于生物素。除延長半衰期W外，生物素也可W 充當親和手柄W從組織或其它位置收回膚。在一個實施方案中，膚可用PEG連接子（例如 NHS-dPEG4-生物素酶化iotinidase)抗性生物素）綴合于例如生物素酶抗性生物素。在 一些實施方案中，可使用可用作可檢測標記與親和手柄的巧光生物素綴合物。市售巧光 生物素綴合物的非限制性實例包括Atto425-生物素、Atto488-生物素、Atto520-生 物素、Atto-550生物素、Atto565-生物素、Atto590-生物素、Atto610-生物素、Atto 620-生物素、Atto655-生物素、Atto680-生物素、Atto700-生物素、Atto725-生物素、 Atto740-生物素、巧光素生物素、生物素-4-巧光素、生物素-(5-巧光素）綴合物，和生物 素-B-藻紅素、alexafluor488 生物胞素、alexaflour546、alexafluor549、巧光黃尸 胺生物素-X、巧光黃生物胞素、俄勒岡綠（化egongreen) 488生物胞素、生物素-若丹明和 四甲基若丹明生物胞素。在一些其它實例中，綴合物可包括化學發光化合物、膠態金屬、發 光化合物、酶、放射性同位素和順磁性標記。
[0050] 在一些方面，本發明的融合蛋白和膚可綴合于維生素或通常見于食物的從胃、小 腸或結腸吸收到血流中的其它分子。實例包括但不限于維生素A、維生素C、維生素B2、維生 素B3、維生素Be、維生素Bi2、維生素D、維生素E、維生素K。運些綴合的目標是提高口服生物 利用率或自胃腸系統的膚的吸收。