用于預測對于治療的響應性的遺傳標記的制作方法

用于預測對于治療的響應性的遺傳標記的制作方法
【專利說明】用于預測對于治療的響應性的遺傳標記
[0001] 發明領域設及患有屯、血管病癥的受試者的治療或預防。
[0002] 盡管20年前一種治療適合所有是通向強有力的"重磅炸彈"藥物所采取的途徑。 現在，隨著人類基因組測序和分子表達譜（molecularprofiling)技術的進步，藥物開發的 途徑正采取更具層次化或個體化的途徑。運些進步逐漸允許將個體分類為處于特定疾病的 風險、響應于特定治療、不響應于特定治療或當治療時處于不良事件的高風險的亞群。因此 遺傳測試可W用于告知診斷、預后和治療選擇。許多研究已經顯示了基因型和對藥物治療 的響應之間的關系。運種途徑在過去幾年已經被廣泛接受，尤其是在其中許多個體化藥物 途徑已經被成功開發并且已經提供了臨床結果中的大的改進的腫瘤學中。
[0003] 在屯、血管病癥中，對于特定的治療干預來說，人群按照基因型分層是有限的。本 發明的目標之一是證明，罹患屯、血管病癥的人群可能行為不同并且因此可W對特定治療 做出不同的反應。降低LDL是屯、血管疾病的治療中的重要治療策略。實際上，降低LDL的 抑制素藥物，如可定（Crestor)、立普妥（Xipitor)、普拉固（Pravachol)、和Zocar廣泛使 用并且是最主要的處方藥之一。一段時間內，也已經通常接受的是，在屯、血管疾病中增加 皿L也可W是治療性的。已經開發了多種藥物皿L升高藥物，包括：煙酸和CETP抑制劑如 托塞曲匹（torcetrapib)、安塞曲匹（anacetrapib)、依塞曲匹（evacetrapib)和達塞曲匹 (dalcetrapib)。
[0004] 膽固醇醋轉移蛋白（CET巧也被稱為血漿脂質轉移蛋白是在多個組織中但是主要 在肝臟中合成的疏水糖蛋白。CETP促進全血漿脂蛋白粒子之間的膽固醇醋和甘油=醋的 雙向轉移。通過具有CETP遺傳缺陷的人中的觀察提供了第一證據CETP活性對血漿脂蛋白 的影響。在日本1989年確定了第一CETP突變為明顯提高的皿L-C的原因。從那時起已經 在亞洲人中確定了十個在高加索人中確定了一個與CETP缺陷有關的突變。在日本發現， 57%的具有皿心0 >IOOmgML的水平的受試者具有CETP基因的突變。此外，37%的具有 75-lOOmg/化之間的皿kC的水平的日本人具有CETP基因的突變。隨后，用抗CETP抗體治 療的動物的研究顯示，CETP抑制引起皿kC的濃度的顯著增加。與用抗CETP抗體治療的 CETP缺陷患者和兔子中的運些觀察一致，從那時起已經發現，用CETP抑制劑藥物治療人類 增加了皿L膽固醇和apoA-I化DL中主要的載脂蛋白）的濃度。許多流行病學研究已經將 CETP活性變化的作用與冠狀動脈屯、臟病風險建立了聯系，包括人類突變的研究化irano， K.I.Yamishita，S.和MatsuzawaY(2000)Qirr.Opin.Lipido. 11(4)，389-396)。
[0005] 動脈粥樣硬化及其臨床后果，包括冠狀動脈屯、臟病（CHD)、卒中和外周血管疾病， 在國際上構成了對衛生保健系統的巨大負擔。抑制CETP的藥物（CETP抑制劑）已經處于開 發中一段時間，并且預期的是，它們將會可用于治療或預防動脈粥樣硬化。多種類型的CETP 抑制劑藥物已經顯示在人中增加皿L降低LDL并且對治療動脈粥樣硬化和屯、血管疾病具 有治療效果，包括達塞曲匹、托塞曲匹、安塞曲匹、依塞曲匹、BAY60-5521和其他（表1)。
[0006] 表1 :領先的CETP抑制劑藥物和臨床狀態的概述
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[0009] 然而，存在運些藥物可能不會在所有患者中安全且有效的證據。由于發生了患者 的死亡，與單獨用阿托伐他汀（atorvastatin)治療的患者相比，向該患者同時施用了托塞 曲匹和阿托伐他汀，托塞曲匹的臨床試驗在III期終止。在運種情況下，由于相對于單獨的 抑制素缺乏功效，達塞曲匹的臨床試驗也在III期暫停。在臨床試驗和稍早階段的開發中 仍然在尋找另外的CETP抑制劑。通常，使用提供更好功效、降低脫祀作用的CETP抑制劑的 治療策略將會是臨床上有益的。需要用于預測對CETP抑制劑的響應并且獲取與CETP抑制 劑的施用有關的不良事件的風險的生物標記、方法和途徑。
[0010]CETP抑制劑可用于治療和/或預防動脈粥樣硬化（atherosclerosis)，外周血管 疾病（peripheralvas州Iardisease),異常脂肪血癥（dyslipidemia)，高0脂蛋白血癥 (hyperbetalipoproteinemia)，低a脂蛋白血癥化7口〇日1地日11口〇口1'〇16；[]161111日），高膽固 醇血癥化ypercholesterolemia)，高甘油立醋血癥化ypertriglyceridemia)，家族性高膽 固醇血癥（familialhypercholesterolemia),屯、血管病癥（cardiovasculardisorder)， 絞痛（angina)，缺血（ischemia),屯、臟缺血（cardiacischemia),卒中（stroke),屯、肌 梗死（myocardialinfarction),再灌注損傷Cr巧erfusionin化巧），血管成形再狹窄 (angioplasticrestenosis),高血壓化ypertension)，W及糖尿病（di油etes)、肥胖癥 (obesity)或內毒素血癥（endotoxemia)的血管并發癥（vascularcomplication)。
[0011] 臨床試驗具有顯示，患者對利用藥物的治療的響應通常是各種各樣的。迫切需要 改善藥物開發、臨床開發和藥物對患者中的個體或亞群的治療影響。SNP可W用于鑒定最 適合利用特定藥物試劑的治療的患者（運通常被稱為"藥物基因組學"）。類似地，由于患 者產生有毒副作用的增加的可能性或它們不響應于治療的可能性，SNP可W用于從某些治 療中將患者排除在外。還可W在藥物研究中使用藥物基因組學W輔助藥物開發和選擇過 程。Linder等人，ClinicalChemistry43:254(1997) ;MarshalI，NatureBiotechnology 15:1249(1997);國際專利申請WO97/40462，SpectraBiomedical;和Schafer等人，化Uire Biotechnology16:3(1998)。
[0012] 在最近因急性冠狀動脈綜合征（AC巧住院的穩定C皿患者中，達塞曲匹死亡和發 病試驗（dal-OUTCOME巧是雙盲的、隨機化的、安慰劑對照的、平行組、多中屯、研究。進行研 究W測試W下假設：在最近患有ACS的患者中，通過經由CETP抑制來升高皿L-C的水平， CETP抑制將會降低復發的屯、血管事件的風險。合格的患者進入大約4至6周的單盲安慰劑 準備階段，W使得患者穩定并且完成計劃的再血管化（revascularization)過程。在準備 階段的末期，Wl: 1的比率將穩定狀態下的合格患者隨機化至600mg的達塞曲匹或安慰 劑，并進行基于證據的用于ACS的醫療護理。達塞曲匹是膽固醇醋轉移蛋白（CET巧的抑制 劑。已經顯示其在多種動物物種和在人中引起CETP活性的與劑量有關的降低W及皿kC 水平的增加。通過不同途徑降低CETP活性已經在多種動物模型中顯示出抗動脈粥樣硬化 效果。由于沒有效果，試驗在2012年5月由DSMB中斷。da^OUTCOMES(da^結果）研究得 到了與屯、血管疾病進展有關的意外的觀察。盡管皿kc明顯增加，治療中的患者未顯示出 屯、血管事件的明顯減少并且終止了研究。
[0013] 在終止da^OUTCOMES研究之后，假設研究中的患者的亞組對達塞曲匹響應不同 并且達塞曲匹可W在患者的亞群中具有明顯的治療效果。為了患者分層和為了治療選擇， 進行da^OUTCOMES研究人群的藥物基因組學研究，W研究在達塞曲匹響應中的個體間差 異并且鑒定用于預測對達塞曲匹、或其他CETP抑制劑的治療響應的遺傳標記。
[0014] 本發明提供用于選擇能夠受益于利用皿L升高劑或皿L模擬劑、尤其利用CETP抑 制劑/調節劑的治療的個體的基因分型（genotyping)方法、試劑和組合物，尤其是其中該 個體患有屯、血管病癥。本發明還提供治療患有屯、血管病癥的患者的方法，所述方法包括將 受益于利用皿L升高劑或皿L模擬劑、尤其利用CETP抑制劑/調節劑的治療的患者的基因 分型和選擇。意外地，dal-OUTCOMES患者群體的藥物基因組學研究發現了單核巧酸多態性 (SNP)，為與個體對達塞曲匹的響應有關的并且可用于預測對皿L升高劑或皿L模擬劑（特 別是CETP抑制劑/調節劑）的治療響應W及用皿L升高劑或皿L模擬劑（特別是CETP抑 制劑/調節劑）治療患者的遺傳標記。
[0015] 在本發明的基因分型方法中檢測到的遺傳標記包括：在16號染色體上的9型 腺巧酸環化酶（ADCY9)基因中存在的 15 個SNP、rsl967309、rsl2595857、rs2239310、 rsll647828、rs8049452、rsl2935810、rs74702385、rsl7136707、rs8061182、rslll590482、 rs4786454、rs2283497、rs2531967、rs3730119 和rsl3337675,特別是rsl967309,其與對 皿L升高劑或皿L模擬劑、特別是CETP抑制劑/調節劑的響應顯著相關（P= 4. 11 ? 10-8)。
[0016] 本發明的其他基因標記包括ADCY9基因中的SNP，其與rsl967309處于連鎖不平衡 或提供具有P< 0. 05的關聯信號，并且可W提供rsl967309的可用的替代生物標記。在一 個實施方案中，檢測到由與rsl967309處于連鎖不平衡而遺傳的SNP組成的替代生物標記， 并且推斷出rsl967309的基因型。
[0017] 本發明設及用皿L升高藥物、特別是CETP抑制劑對患者進行基因分型和治療的方 法。在rsl967309處的S種基因型預測個體對皿L升高藥物、特別是CETP抑制劑的響應： AA、AG和GG。在運些中，AA基因型與用皿L升高藥物治療的患者中的提高的治療響應有關，AG基因型與部分響應有關并且GG基因型與缺乏響應（不響應）有關。對于本發明的目的 來說：攜帶AA基因型的患者可W受益于利用皿L升高藥物的治療；攜帶AG基因型的患者可 W受益于利用皿L升高藥物的治療并且攜帶GG基因型的患者不能受益于利用皿L升高藥 物的治療。在rsl967309處的兩種基因型AA和AG表示在患有屯、血管病癥的患者中對CETP 抑制劑、特別是達塞曲匹的治療響應。具體地，rsl967309的AA基因型表示在患有屯、血管 病癥的患者中對CETP抑制劑、特別是達塞曲匹的較大的治療響應。
[0018] 本發明設及含有多態性或基因變體的核酸分子，由運些核酸分子編碼的變體蛋 白、用于檢測多態性核酸分子的試劑，和使用核酸分子和蛋白的方法W及使用試劑用于它 們的檢測的方法（例如，用于在本發明的基因分型方法中使用的引物和探針）。
[0019] 在一個實施方案中，本發明提供：檢測本發明的基因變體的方法W及用于在運些 方法中使用的檢測試劑，如探針或引物。
[0020] 本發明具體提供，與對皿L升高劑或皿L模擬劑、特別是CETP抑制劑/調節劑的 治療響應有關的遺傳標記，W及含有本發明的基因變體的合成核酸分子（包括DNA和RNA 分子）。本發明還提供由含有運種基因變體的核酸分子編碼的變體蛋白，針對所編碼的變體 蛋白的抗體，含有新型基因變體或SNP信息的基于計算機的數據儲存系統，檢測試驗樣品 中的運些SNP的方法，基于存在或不存在一個或多個本發明的基因變體或一個或多個編碼 的變體產物（例如，變體HiRNA轉錄物或變體蛋白）的檢測來鑒定當施用皿L升高劑或皿L 模擬劑、特別是CETP抑制劑/調節劑時治療上響應的個體的方法，W及治療攜帶本發明的 基因變體中的一種或多種的患有屯、血管疾病的個體的方法。
[0021] 本發明的示例性實施方案還提供了用于選擇或制定治療方案的方法（例如，用于 確定是否向個體施用皿L升高劑或皿L模擬劑、特別是CETP抑制劑/調節劑治療的方法）。
[0022] 本發明的多個實施方案還提供用于基于個體的基因型選擇可W向其治療上施用 皿L升高劑或皿L模擬劑（特別是CETP抑制劑/調節劑）的個體的方法，W及用于基于個 體的基因型選擇用于參加皿L升高劑或皿L模擬劑（特別是CETP抑制劑/調節劑）的臨 床試驗的個體的方法（例如，基于它們的基因型，尤其是在rsl967309處它們的基因型是 AA，選擇最可能正向響應的個體參加試驗和/或將不大可能對治療正向響應的個體從試驗 中排除，或者選擇不大可能正向響應的個體參加可W從其中受益的備選藥物的臨床試驗。
[0023] 可W將本發明的核酸分子插入在表達載體中，W在宿主細胞中制備變體蛋白。因 此，本發明還提供包含本發明的含SNP的核酸分子的載體，含有該載體的基因改造的宿主 細胞，W及用于利用運種宿主細胞表達重組變體蛋白的方法。在另一個具體實施方案中，可 W使用宿主細胞、含SNP的核酸分子、和/或變體蛋白作為用于篩選或鑒定治療劑的方法中 的目標，所述治療劑是皿L升高劑或皿L模擬劑（特別是CETP抑制劑/調節劑）。
[0024] 可W在本文中確定/評價的ADCY9的示例性SNP提供了用于鑒定對達塞曲匹的提 高的響應的方法，所述方法是運樣的：如在SEQ.ID.NO. 1和2中所示，其中突變引起在位置 4, 062, 592和4, 065, 583 (基因組組件GRCh37.p5)處的核巧酸序列的改變，其也被分別稱為 具有標識符rsl2595857和rsl967309的單核巧酸多態性。
[0025] 本發明基于遺傳多態性的鑒定，所述遺傳多態性預測利用皿L升高劑或皿L模擬 劑、特別是CETP抑制劑/調節劑的治療將會使患有屯、血管病癥的患者受益的增加的可能 性。
[0026] 圖1 :本發明的SNPrsl967309和rsl2595857與用CETP抑制劑達塞曲匹治療的患 者中的屯、血管事件（主要復合事件或未預見的冠狀動脈再血管化）的減少顯著相關。該圖 示出了關于來自da^OUTCOMES研究的治療組的樣品的全基因組關聯研究（GWA巧的結果。 A圖示出了關于在16號染色體上的ADCY9基因區中強信號的邏輯回歸的Manhattan圖表。 每個點表示用于比較在治療期間經歷屯、血管事件的參與者與未經歷屯、血管事件的那些參 與者的P值，其針對性別和遺傳血統的5個主要成分調節。B圖示出了ADCY9區中單核巧酸 多態性（SNP)的P值。在治療期間的屯、血管事件與rsl967309SNP和與rsl967309處于連 鎖不平衡的相鄰的SNPrsl2595857之間存在強的關聯。X軸示出了在16號染色體上的SNP 位置（國家生物技術信息中屯、，組件GRCh37.p5)。左邊的y軸示出了如在A圖中描述的用 于屯、血管事件與無事件之間的比較的P值的負logi。。右邊的y軸示出了在16號染色體上 的重組率。菱形示出了如根據來自HapMap的參比(EU樣品估算的樣品中的連鎖不平衡度 (LD)O
[0027] 圖2 :分別根據達塞曲匹和安慰劑治療組的研究終止并且根據ADCY9基因中的 rsl967309基因型的屯、血管事件（dal-OUTCOMES主要復合事件或未預見的冠狀動脈再血管 化）的頻率。事件的百分數W95%CI報告。
[0028] 圖3 :分別針對達塞曲匹治療組和安慰劑組并且通過在ADCY9基因中的 rsl967309SNP處的S種基因型（GG、AG、AA)分層的屯、血管事件（dal-OUTCOMES主要復合事 件或未預見的冠狀動脈再血管化）的累積發病率。
[0029] 圖4 :示出了根據24個月的治療期間的基因型的脂質水平的變化。A圖。根據達 塞曲匹治療組的ADCY9SNPrsl967309的基因型組的從基線到1個月的脂質值的變化的平 均值+SE(HigAlL)。示出P值用于脂質的變化與基因型之間的單變量統計。B圖。治療組 中患者的da^OUTCOMES試驗的后續階段期間LDL膽固醇的絕對值的平均值±95%CI。P 值用于多變量混合回歸模型。
[0030] 圖5 :示出根據來自da^Outcomes的遺傳研究的6297名個體W及來自1000基因 組數據組的83C抓祖先（founder)、186JPT-C皿和88YRI祖先的76, 854個SNP的前兩個維 度（CUC2)的MDS圖表。
[003。 圖6 :通過根據來自（M-Outcomes的遺傳研究的6297名個體W及來自1000基因 組數據組的83C抓祖先、186JPT-C皿和88YRI祖先的76, 854個SNP的主要組件分析中的前 十個成分解釋的累積方差的圖表。
[003引圖7 :觀察的-IoglOP值相對于MAF> 0. 05的SNP的全基因組關聯的在零假設下 的期望的分位數-分位數怕曲圖表。陰影區域是通過計算在零假設下的分布的第2. 5和第 97. 5百分位數而形成的95%集中帶。點表示來自PLINK中的邏輯回歸的分級的（ranked) P值，其用于比較在治療期間經歷屯、血管事件的治療組中的da^Outcomes參與者與未經歷 屯、血管事件的那些參與者，并且針對性別和遺傳血統的5個主要成分調節。
[0033] 圖8 :示出在顯著相關的SNPrsl967309周圍的ADCY9基因的連鎖不平衡方式 (r2)的熱圖。區塊6 7、8和9示出了與rsl967309處于高度連鎖不平衡的區域，其橫跨SNP rsl2935810 到SNPrsl3337675 的位置Chrie:4049365 到C虹 16 :4077178(組件GRCh37/ hgl9)。
[0034] 在本文中公開了本發明的各種特征和實施方案，然而基于所提供的教導，對于相 關領域的技術人員來說本發明的其他特征、修改和等同物將會是顯而易見的。所描述的發 明不限于所提供的實例和實施方案，各種替代方案、等同物將會被本領域技術人員理解。如 在本文中所使用的，單數形式"一個"、"一種"和"所述"包括復數，除非上下文明確地另外 指出。例如，"一個"細胞也將會包括"多個細胞"。
[0035] "等位基因"被定義為給定的基因的任何一個或多個備選形式。在二倍體細胞或生 物中，等位基因對的成員（即給定的基因的兩個等位基因）占據一對同源染色體上的相應 位置（基因座），并且就特定的基因而言，如果運些等位基因是遺傳學上相同的，則該細胞 或生物被稱為"純合的"，但是如果是遺傳學上不同的，則該細胞或生物被稱為"雜合的"。
[0036] "基因"是位于特定染色體上的特定位置的核巧酸的有序序列，其編碼特定的功能 產物并且可W包括與編碼區鄰接的不翻譯和不轉錄的序列。運種非編碼序列可W含有序列 的轉錄和翻譯所需的調節序列或內含子等，或者可W另外具有由于它們超越目標SNP的存 在的任何功能。
[0037] "基因分型"是指個體在基因組中的一個或多個位置所攜帶的遺傳信息的確定。例 如，基因分型可W包括個體因一個SNP而攜帶一個等位基因或多個等位基因的確定或者個 體因多個SNP而攜帶一個等位基因或多個等位基因的確定。例如，在rsl967309,在一些個 體中核巧酸可W是A，并且在其他個體中可W是G。那些在該位置具有A的個體具有A等位 基因并且具有G的那些具有G等位基因。在二倍體生物中，個體將具有兩個拷貝的含有多 態性位置的序列，因此個體可W具有A等位基因和G等位基因，或者備選地，兩個拷貝的A 等位基因或兩個拷貝的G等位基因。那些具有兩個拷貝的G等位基因的個體是G等位基因 純合的，那些具有兩個拷貝的A等位基因的個體是A等位基因純合的，并且那些具有一個拷 貝的每種等位基因的個體是雜合的。等位基因通常被稱為A等位基因，其通常是主要的等 位基因