四種大腸埃希氏菌的檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及分子生物學和食品安全檢測領域，具體為四種大腸埃希氏菌的檢測試 劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 生鮮食品如果蔬類、肉禽類、海產類及其加工產品中普遍存在大腸埃希氏菌，大腸 埃希氏菌是一種條件致病菌，在普通情況下是動物大腸的主要互生菌，對調節人體腸道菌 群平衡，促進大腸對維生素的吸收有重要的積極作用。但一些發生了基因變異的大腸埃希 氏菌會產生毒素，危及人類健康，甚至引發大規模的傳染性疾病。傳統檢測大腸埃希氏菌的 方法采用細菌培養、分離、鑒定等一系列步驟，不僅操作時間長，而且檢出敏感性差，不利于 對食品質量把關。所W發明一種耗時短，易推廣的檢測方法對其進行檢測、監控，對保障食 品生產、加工及物流過程中的質量安全具有積極的作用。
【發明內容】
[0003] 為解決上述問題，本發明提供一種可同時檢測四種大腸埃希氏菌的檢測試劑盒及 檢測方法，具有檢測時間短、靈敏度高的特點。本發明通過W下技術方案實現：四種大腸埃 希氏菌的檢測試劑盒，該試劑盒包括W下組分：
[0004] (1)腸道致病性大腸埃希氏菌的引物：上游引物5' 一CTGAACGGCGATTACGCG AA- 3'，下游引物 5' 一CCAGACGATACGATCCAG- 3'，濃度為 0. 3-0. 5ymol/L;
[000引 似腸產毒素性大腸埃希氏菌的引物：上游引物5' 一GGCGACAGATTATACCGT GC- 3，，下游引物 5, 一CGGTCTCTATATTCCCTGTT- 3，，濃度為 0. 5-0. 7ymol/L; [000引 做腸道侵襲性大腸埃希氏菌的引物：上游引物5' -CTGGATGGTATGGTGAGG- 3,，下游引物 5' 一GGAGGCCAACAATTATTTCC- 3'，濃度為 0. 7-0. 9ymol/L;
[0007] (4)腸道出血性大腸埃希氏菌0157:H7的引物：上游引物5' 一CTTTTCTAACTC TGGTGTCGG-3'，下游引物 5'一TTGGTAGGGGTTGTATGC-3'，濃度為 0.1-0.Symol/L；
[000引 巧)TaqDNA聚合酶濃度為：1-2U/yL;
[0009](6) IOX聚合酶鏈式反應緩沖液：8-12vt% ;
[0010] (7)]\%(：12濃度為：1-3111111〇1/1;
[0011] (8)脫氧核糖核巧S憐酸濃度為：0. 1-0. 3mmol/L。
[0012] 優選的，該試劑盒包括W下組分：
[001引 （1)腸道致病性大腸埃希氏菌的引物：上游引物5' 一CTGAACGGCGATTACGCG AA- 3'，下游引物 5' 一CCAGACGATACGATCCAG- 3'，濃度為 0. 4ymol/L;
[0014] 似腸產毒素性大腸埃希氏菌的引物：上游引物5' 一GGCGACAGATTATACCGT GC- 3，，下游引物 5, 一CGGTCTCTATATTCCCTGTT- 3，，濃度為 0. 6ymol/L;
[001引 做腸道侵襲性大腸埃希氏菌的引物：上游引物5 ' 一CTGGATGGTATGGTGAGG- 3,，下游引物5,一GGA GGC CAA CAA TTA TTT CC-3,，濃度為0. 8 ymol/L ;
[001引（4)腸道出血性大腸埃希氏菌0157:H7的引物：上游引物5' -CTT TTC TAA CTC TGG TGT CGG_3'，下游引物 5' _TTG GTA GGG GTT GTA TGC_3'，濃度為 0. 2ymol/L ;
[0017]巧)TaqDNA聚合酶濃度為：1. 5U/yL;
[0018] (6) 10X聚合酶鏈式反應緩沖液：IOvt%;
[0019] (7)]\%(：12濃度為：2111111〇1/1;
[0020] (8)脫氧核糖核巧S憐酸濃度為：0.2mmol/L。
[0021] 本發明同時請求保護所述四種大腸埃希氏菌的檢測試劑盒的檢測方法，該方法包 括W下順序的步驟：
[0022] (一）制備陽性對照
[0023] (1)將腸道致病性大腸埃希氏菌、腸產毒素性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希 氏菌、腸道出血性大腸埃希氏菌〇157:H7進行活化培養，分別得到四種菌的培養液；
[0024] 似分別取步驟（1)所得四種菌的培養液與LysisBuffer細胞裂解液混合均勻 后，置于80°C的水浴中，裂解30min，取出后離屯、4min，取上清液作為聚合酶鏈式反應模板；
[0025] (3)分別取步驟（2)所得聚合酶鏈式反應模板，添加到試劑盒中，在聚合酶鏈式反 應擴增儀上解育，其參數為95°C預熱變性3min，94°C變性30s，60°C引物退火30s，72°CDNA 延伸40s，30個循環，72°C延伸IOmin再冷卻至4°C，結束聚合酶鏈式反應擴增，分別得到四 種菌的擴增產物；
[0026] (4)分別取步驟（3)得到四種菌的擴增產物與6XLoadingbuffer緩沖液混勻，在 95V恒壓下于3wt%的瓊脂糖凝膠中，電泳50min;在GelRed染料稀釋液里染色20min，所述 GelRed染料稀釋液為：15微升GelRed和5mLIM化Cl混勻后加到45ml蒸饋水中，可分別 得到四種菌的條帶，作為陽性對照.
[0027](二）檢測樣品
[002引（1)將待測樣品放入裝有蛋白腺水的無菌均質袋中，在均質器上拍打均勻，得到樣 液；
[002引似取樣液加入到Lysis Buffer細胞裂解液中，80°C水浴裂解20min后，離屯、 lOmin，取上清液作為聚合酶鏈式反應模板；
[0030] (3)取步驟（2)所得聚合酶鏈式反應模板，添加到試劑盒中，在聚合酶鏈式反應擴 增儀上解育，其參數為95°C預熱變性3min，94°C變性30s，60°C引物退火30s，72°CDNA延伸 40s，30個循環，72°C延伸IOmin再冷卻至4°C，結束聚合酶鏈式反應擴增，得到樣品擴增產 物；
[00引](4)取步驟（3)得到的樣品擴增產物與6XLoadingbuffer緩沖液混勻，在95V恒 壓下于3wt%的瓊脂糖凝膠中，電泳50min;在GelRed染料稀釋液里染色20min，將所得條 帶分別與陽性對照。
[0032] 優選的，所述的活化培養為：將腸道致病性大腸埃希氏菌、腸產毒素性大腸埃希氏 菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌、腸道出血性大腸埃希氏菌〇157:H7分別接種于LB液體培養 基中，置于37°C，培養24h。
[0033] 本發明的有益效果如下：
[0034] (1)本發明提供的試劑盒和檢測方法可同時檢出食品中的4種大腸埃希氏菌，檢 測靈敏度高；
[003引似本發明提供的試劑盒和檢測方法可在3-6小時內完成檢測，耗時短，檢測速度 快；
[003引做本發明提供的試劑盒和檢測方法相比測序、雜交及忍片等傳統檢測技術，本發 明方法的檢測程序簡單、易推廣，可W推廣至食品生產企業及相關檢測機構使用。
【附圖說明】
[0037]圖1為本發明檢測結果電泳圖；
[003引其中：l、1000bp DNA marker, 2、待檢測樣品，3、腸道致病性大腸埃希氏菌，4、產腸 毒素大腸埃希氏菌，5、腸道侵襲性大腸埃希氏菌，6、腸道出血性大腸埃希氏菌0157 :H7,7、 陰性對照。
【具體實施方式】
[0039]W下通過實施例對本發明做進一步說明：
[0040] 如無特殊說明，本發明所用原料均市售可得，作為優選，本實施例中所用試劑均購 自寶生物工程（大連）有限公司；聚合酶鏈式反應擴增儀：Thermo Scientific Arkt化系列 多功能PCR儀購自美國賽默飛科技有限公司；腸致病性大腸埃希氏菌CICC 10663、腸產毒 性大腸埃希氏菌CICC 10665、腸侵襲性大腸埃希氏菌CICC 10661、大腸桿菌0157 :H7 CICC 21530均購自中國工業微生物菌種保藏中屯、；本實施例試劑盒的反應體系為25 y L ;
[0041] 實施例通過W下方法制備陽性對照：
[0042] (1)將腸道致病性大腸埃希氏菌、腸產毒素性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃 希氏菌、腸道出血性大腸埃希氏菌0157:H7分別接種于LB液體培養基中，置于37°C，培養 24h，分別得到四種菌的培養液；
[004引 似分別取步驟（1)所得四種菌的培養液培養液1000化與80yLLysisBuffer 細胞裂解液混合均勻后，置于80°C的水浴中，裂解30min，取出后離屯、4min，取上清液作為 聚合酶鏈式反應模板；
[0044] (3)分別取步驟（2)所得聚合酶鏈式反應模板1 ^以添加到試劑盒中，在聚合酶 鏈式反應擴增儀上解育，其參數為95°C預熱變性3min，94°C變性30s，60°C引物退火30s， 72°CDNA延伸40