快速檢測α2變異等位基因的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及醫學檢測技術領域，具體設及一種快速檢測a2變異等位基因的試劑 盒。
【背景技術】
[0002] 在申請人的研究過程中，發現一種新型的a -珠蛋白基因簇（NG_000006. 1)中 曰2基因的變異基因型，該基因型被描述為HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC。申請人還發現 該基因型在廣西有一定的分布幾率，為對該基因型進行檢測，需要建立一種可W快速檢測 HBA2: C. 301-24delinsCTCGGCCC等位基因的試劑盒。
【發明內容】
[0003]本發明要解決的技術問題是提供一種快速檢測a2變異等位基因（即目標區段為 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC等位基因）的試劑盒。
[0004]本發明所述的快速檢測a2變異等位基因的試劑盒，包括擴增引物和巧光探針， 其特征在于：
[0005]所述a 2變異等位基因為a -珠蛋白基因簇（NG_000006. 1)中a 2基因的變異基 因型，該基因型被描述為HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC，序列具體為：
[0006] 邑邑邑tt邑C邑邑邑a邑邑t邑ta邑C邑Ca邑邑C邑邑C邑邑Ct邑C邑邑邑CCt邑邑邑ccCTCGGCCCcact邑accctcttctc tgcacagctcctaagccactgcctgctggtgaccctggccgcccacctccccgccgagttcacccctgcggtgcacg cctccctggacaagttcctggcttctgtgagcaccgtgctgacctccaaataccgttaagctggagcctcggtagcc gttcctcctgcccgctgggcctcccaacgggccctcctcccctccttgcaccggcccttcctggtctttgaataaag tctgagtgggcagcagcctgtgtgtgcctgggttctctctatcccggaatgtgccaacaatggaggtgtttacctgt etc過g過CC過過gg3 ;
[0007] 所述的擴增引物為：一對可W擴增a-珠蛋白基因簇中 HBA2:C.301-24delinsCTCGGCCC等位基因的特征序列的引物A2V-F和A2V-R，一對可W擴增 內參基因GAPDH片段的引物GAPDH-F和GAPDH-R;
[0008] 所述的巧光探針為：一條特異性檢測A2V-F和A2V-R擴增產物的巧光探針 A2V-Prob，一條特異性檢測GAPDH-F和GAPDH-R擴增產物的巧光探針GAPDH-Prob ;
[0009] 其中：
[0010] 所述的可W擴增a -珠蛋白基因簇中HBA2 :c. 301-24delinsCTCGGCCC等位基因的 特征序列的引物中，
[0011] A2V-F: 5，-GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3，；
[0012] A2V-R: 5，-TCCTTGGTCTGAGACAGGTA-3，；
[001引所述的可W擴增內參基因GAPDH片段的引物對中，
[0014] GAPDH-F: 5，-CCCCACACACATGCACTTACC-3，；
[0015] GAPDH-R: 5' -CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3';
[0016] 所述的特異性檢測A2V-F和A2V-R擴增產物的巧光探針A2V-Prob為：
[0017] A2V-Prob: 5，-6-R0X-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-B冊-1-3，。 陽0化]所述的特異性檢測GAPDH-F和GAPDH-R擴增產物的巧光探針GAPDH-Prob為：
[0019] GAPDH-Prob: 5' -CY5-AAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGC-B冊-2-3，。
[0020] 本發明所述的巧光探針中，ROX指簇基-X-羅丹明，CY5是指花青染料分子5,B冊-1 和B冊-2是指巧光澤滅基團。
[0021] 本發明所述的快速檢測a2變異等位基因的試劑盒，還包括一些現有試劑盒中常 規且必須的組分，如緩沖液、酶液、MgClz和dNTP。具體地，酶液為Taq聚合酶體系，包括可 用于水解探針法的熱啟動酶體系等；所述緩沖液為常規的PCR緩沖液。當酶液選擇采用康 為世紀所生產的GoldStarTaqDNAPolymerase時，緩沖液則優選為與GoldStarTaqDNA Polymerase配套的緩沖液。
[0022] 采用上述試劑盒快速檢測a2變異等位基因的方法包括W下步驟： 陽02引 1)抽提樣本基因組DNA，制備DNA模板；
[0024] 2)配制反應體系，具體為： 陽0巧]將引物A2V-F、A2V-R、GAPDH-F和GAPDH-R，巧光探針A2V-Prob和GAPDH-Prob,W及PCR緩沖液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反應體系；
[00%] 3)樣本檢測：分別將配制的反應體系進行PCR擴增，記錄每個PCR反應管內的巧 光信號到達設定的域值時所經歷的循環次數Cq(Cq值的大小可W反映所檢測模板數的多 少）；
[0027] 4)數據分析及結果判定：根據實時巧光定量PCR儀自帶的分析軟件分析判讀結 果；當CY5通道有Cq值讀數時，則該樣本被正常擴增；在CY5通道有讀數的前提下，若ROX通 道有讀數，則表示該樣本攜帶HBA2:C. 301-24delinsCTCGGCCC等位基因；在CY5通道有讀數 的前提下，若ROX通道沒有Cq值讀數，則表示該樣本不攜帶HBA2:C.30l-24delinsCTCGGCCC 等位基因。
[0028] 上述方法的步驟1)中，采用現有常規方法制備DNA模板。
[0029] 上述方法的步驟2)中，反應體系中各組分的濃度優選為：待檢測DNA:1~化g/ 化；各引物：〇. 3~0. 5ymol/L;各巧光探針濃度為0. 3~0. 5ymol/L;DNA模板：20~ 20化g;儀離子：1. 5~1. 9mmol/L;反應體系的終體積優選為20JiL。
[0030] 上述方法的步驟3)中，PCR擴增條件為：95°C預變性8~12分鐘，然后95°C15~ 30秒，60°C退火50~70秒，39~49個循環，于60°C退火步驟末采集巧光信號。
[0031] 與現有技術相比，本發明的特點在于：
[0032] 1、采用本發明所述試劑盒可W實現單管單次反應直接完成 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC等位基因的檢測；對HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC等位 基因檢測具有高度的靈敏性、穩定性和準確性，W及較高的特異性。
[003引 2、本發明無需開管操作，極大限度地降低了實驗室PCR產物污染的可能。
【附圖說明】
[0034] 圖1為本發明實施例1中1#樣本的擴增曲線；
[0035] 圖2為本發明實施例1中2#樣本的擴增曲線。
【具體實施方式】
[0036]下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳述，W更好地理解本發明的內容，但 本發明并不限于W下實施例。
[0037]實施例1 :采用本發明所述試劑盒在已知基因型樣本中的檢測結果
[0038] 1、試劑盒的組成：
[0039] (1)可W擴增a -珠蛋白基因簇中HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC等位基因（所 述HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC等位基因的序列具體為：gggttgcgggaggtgtagcgcaggcg gcggctgcgggcctgggccCTCGGCCCcactgaccctcttctctgcacagctcctaagccactgcctgctggtgacc ctggccgcccacctccccgccgagttcacccctgcggtgcacgcctccctggacaagttcctggcttctgtgagcac Cgtgctgacctccaaataccgttaagctggagcctcggtagccgttcctcctgcccgctgggcctcccaacgggccc tcctcccctccttgcaccggcccttcctggtctttgaataaagtctgagtgggcagcagcctgtgtgtgcctgggtt ctctct曰tcccgg曰曰tgtgcc曰曰C曰曰tgg曰ggtgttt曰cctgtctc曰g曰CC曰曰gg曰（SEQIDNO:!))的特征 序列的引物對A2V-F和A2V-R :
[0040] A2V-F:5, -GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3,（沈QID NO :2);
[0041] A2V-R:5, -TCCTTGG