一種檢測jak2基因突變的引物與方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測技術領域，尤其設及一種檢測JAK2基因突變的引物與方法。
【背景技術】
[0002] JAK/STAT通路是造血生長因子廣泛應用的信號傳導通路，該通路的激活與多種腫 瘤相關。JAK2基因編碼Janus酪氨酸激酶2(Januskinase2,JAK2)，參與造血細胞的增 殖、分化、調亡W及免疫調節等多種反應。
[0003] 骨髓增殖性疾病（Myeloproliferativeneoplasms,MPN)是一系或多系分化相對 成熟的骨髓細胞不斷克隆性增殖所致的一組腫瘤性疾病的統稱，其中W真性紅細胞增多癥 (PV)、原發性血小板增多癥巧T)、骨髓纖維化（M巧最常見。MPN發病機制不明，但大部分患 者存在JAK2基因突變的情況，其中，JAK2的14號外顯子V617F突變是最為常見的突變，見 于約95%的PV、約50%的ET和MF患者中。2007年Scott等首次報道JAK2V617F陰性的 PV患者中存在JAK2基因12外顯子的突變，相關研究數據顯示，JAK2基因外顯子12和13 主要影響紅系發育，約2%-4%的PV患者JAK2基因外顯子12、13發生突變，但未發現JAK2 基因外顯子12、13突變與ETW及MF等JAK2V617F陰性的其它MPN的相關性。
[0004] 和JAK2V617F單一位點突變不同，JAK2基因外顯子12的突變形式多樣，設及所 編碼蛋白的第536至547位氨基酸，突變類型包括點突變、缺失及插入，JAK2基因外顯子13 突變形式則主要為點突變（COSMIC)。
[0005] 中國專利申請201110396831. 1公開了檢測JAK2基因突變的引物和探針，該專利 申請將特異性引物與雙環探針相結合，通過巧光PCR實現了JAK2基因突變的檢測，但存在 反應體系復雜，需要多種引物和巧光定量PCR儀的缺點。
【發明內容】
[0006] 為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種檢測JAK2基因突變的引物與方 法，該引物具有特異性好、靈敏度高等優點，實現了檢測JAK2基因外顯子12和外顯子13突 變的準確檢測。本發明檢測的位點包括JAK2基因外顯子12和外顯子13。 陽007] 本發明提供一種檢測JAK2基因突變的引物，包括針對JAK2基因外顯子12的上游 引物TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTTTGGAGCAATTCATAC(沈QIDNO. 1)和下游引物CAGGAAACAG CTATGACCCATCTAACACAAGGTTGGCATA(SEQIDNO. 2)，W及針對JAK2 基因外顯子 13 的上游引 物TGTAAAACGACGGCCAGTTTTCTGTCTCTTATTACTATTTA(SEQIDNO. 3)和下游引物CAGGAAACAG CTATGACCTCCTCAGAAAAGTCCTTGACACATT(SEQIDNO. 4)〇
[0008] 優選地，所述引物中，外顯子12的上游引物、外顯子12的下游引物、外顯子13的 上游引物和外顯子13的下游引物濃度比為1 :1 :1 :1。
[0009] 相應地，本發明還提供一種檢測JAK2基因突變的方法，包括如下步驟：A)提取DNA 樣品；B)采用權利要求1或2中所述的引物進行PCR擴增；C)對擴增產物進行凝膠電泳分 析后，采用Sanger測序法檢測，對檢測結果進行分析。
[0010] 優選地，所述步驟A)中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血或骨髓血的DNA樣品。
[0011] 優選地，所述步驟B)中的PCR擴增反應條件包括：階段1 :98°CSmin;階段2 :98°C 1〇3;階段3:631：3〇3;階段4:72°(：1111111;階段5:返回到階段2,29個循環；階段6:721： Smin;階段7 :25 °C保溫。
[0012] 優選地，所述步驟C)中，采用Sequencher4. 1. 4軟件對檢測結果進行分析。
[0013] 此外，本發明還提供檢測JAK2基因突變的引物在制備檢測JAK2基因突變試劑中 的用途。
[0014]與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明提供了一種檢測JAK2基因外顯子 12和外顯子13突變的引物，該引物的特異性好，準確性好，提高了檢測效率。此外，本發明 還提供了一種檢測JAK2基因外顯子12和外顯子13突變的方法，通過使用特異性的引物， 具有特異性好、靈敏度高、準確性好等優點，可W作為JAK2 V617F檢測陰性的真性紅細胞增 多癥患者的輔助檢測方法，進而為其臨床用藥提供指導。
【附圖說明】
[0015] 圖1本發明提供的JAK2基因外顯子12引物的擴增片段。
[0016] 圖2本發明提供的JAK2基因外顯子13引物的擴增片段。
[0017] 圖3 PCR擴增產物的凝膠電泳圖。
[0018] 圖4 JAK2基因外顯子12野生型的部分測序圖。
[0019] 圖5 JAK2基因外顯子13野生型的部分測序圖。
[0020] 圖6JAK2基因外顯子12突變型的部分測序圖。
[0021] 圖7 JAK2基因外顯子13突變型的部分測序圖。 陽02引圖8同一樣品不同批次的PCR擴增產物的部分凝膠電泳圖。
[002引圖9同一樣品不同孔間的PCR擴增產物的部分凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明。 陽〇2引實施例一引物 發明人針對JAK2基因外顯子12和外顯子13,設計了大量引物，通過引物反應條件的優 化和比較，篩選出了特異性好的引物。
[0026]
實施例二引物的特異性 將本發明提供的引物于UCSC中進行Blasting, JAK2基因外顯子12引物擴增片段位 于C虹9:5069859-5070214間，長度為356bp;JAK2基因外顯子13引物對擴增片段位于C虹9:5072300-5072758,長度為459bp。無其它同源基因，結果如圖1至圖2所示，與JAK2 基因參考序列相符。
[0027]使用表1中的引物、表2中的PCR擴增體系和表3的PCR擴增條件對檢測樣品進 行擴增，對擴增產物進行凝膠電泳分析，結果如圖3所示。結果顯示，擴增產物的特異性高， 無非特異性擴增條帶產生。
[002引實施例SJAK2基因外顯子12和外顯子13突變的檢測 提取邸TA抗凝外周血的DNA樣品，提取方法參照TIANamp Blood DNA Kit(購自Tiagen,貨號：DP318)的說明書，將DNA樣品稀釋至l(K)ng/iiL備用。
[0029] PCR擴增采用Q5?熱啟動超保真2X Master Mix(購自肥B公司，貨號：M049化）， PCR擴增體系如表2所示，PCR擴增條件如表3所示。外顯子12的上游引物、外顯子12的 下游引物、外顯子13的上游引物和外顯子13的下游引物濃度比為1 :1 :1 :1，外顯子12的 上游引物濃度、外顯子12的下游引物濃度、外顯子13的上游引物濃度和外顯子13的下游 引物濃度都為lOp/mol。
[0030]
對PCR擴增產物進行凝膠電泳分析，結果如圖3所示。結果顯示，擴增產物的特異性高， 無非特異性擴增條帶產生。