一種新型內切型褐藻膠裂解酶基因及工程菌和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種新型內切型褐藻膠裂解酶AlgM的基因序列。本發明還設及該重 組褐藻膠裂解酶的畢赤酵母基因工程菌的構建W及利用畢赤酵母表達褐藻膠裂解酶的方 法。本發明還設及利用該重組褐藻膠裂解酶水解較高濃度海藻酸鋼制備褐藻寡糖的方法。
【背景技術】
[0002] 褐藻寡糖是一種最新一代的功能性低聚糖，采用國際領先的分離降解技術得到的 聚合度20W下的褐藻低聚糖，是由P-D-甘露糖醒酸和QA-古羅糖醒酸組成的線型低聚 合物。海藻寡糖分子量低，水溶性強，穩定性高，實驗和臨床已經發現海藻寡糖具有免疫調 節、降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗凝血及抗病毒等多種生理活性，還可W作為糖尿病、 肥胖癥、直腸結腸癌、習慣性便秘患者的療效食品。在藥物研制、功能食品開發、綠色農業等 領域具有廣闊的開發應用前景。
[0003] 近年來，關于低聚糖的研究越來越多，已有多種功能性低聚糖產品投入市場，但目 前大多數低聚糖產品屬于普通型的低聚糖，有效成分不足50%。目前主要采用酸降解法和 氧化降解法降解褐藻膠，可W得到聚合度20W下的系列褐藻膠寡糖。而對于酶降解法降 解褐藻膠獲得褐藻寡糖的研究才剛剛起步，關鍵是目前獲得的褐藻膠裂解酶的活性普遍不 高，為了提高產品純度，必須在后續工藝中使用操作復雜成本過高的提純工序，例如離子交 換色譜法、凝膠過濾色譜法等。酶降解法降解褐藻膠獲得褐藻寡糖，關鍵是褐藻膠裂解酶。 如何尋找高活力的褐藻膠裂解酶，使水解的效果提高，使得產品的純度提高，使后續提純工 序簡單有效，能低成本地生產高純度低聚糖，顯得尤為重要。
[0004] 褐藻膠裂解酶按其降解海藻酸鹽部位與片段的不同可分為兩大類：專一性裂解 1，4糖巧鍵連接的0 -D-甘露糖醒酸的裂解酶巧CA. 2. 2. 3)和專一性裂解1，4糖巧鍵連接 的aA-古羅糖醒酸的裂解酶巧C4. 2. 2. 11)。它們分別作用于海藻酸鹽的甘露糖醒酸段和 古羅糖醒酸段，通過P-消去反應裂解褐藻膠的糖巧鍵，在非還原末端產生C4,e不飽和雙鍵 并在230~240nm有強吸收。褐藻膠裂解酶來源廣泛，包括海洋藻類、海洋軟體動物，刺皮動 物體內和多種微生物（包括海洋細菌、上壤細菌和真菌）。國內現在有許多相關科研單位， 如中國海洋大學、中國科學院海洋研究所、山東大學微生物研究所、浙江大學舟山海洋研究 中屯、、上海海洋大學等廣泛進行了褐藻膠裂解酶及其相關內容的研究，但所報道的發酵酶 活性不高，酶解產物純度低，生產成本高難W工業化。
[0005] 褐藻膠是褐藻口類藻中提取的一種物質。其主要成分為多聚甘露糖醒酸和多聚古 羅糖醒酸所構成的高分子化合物。褐藻膠廣泛存在于巨藻、海帶、昆布、鹿角菜、墨角藻和馬 尾藻等上百種褐藻的細胞壁中。在我國人工養殖海帶非常普遍，產量也很大，所W在我國人 工養殖海帶就成了提取褐藻膠的主要原料。褐藻膠的生產加工企業主要集中在山東青島、 煙臺和威海，江蘇連云港等地。將褐藻膠利用褐藻膠裂解酶經酶法水解制成褐藻寡糖，有很 好的市場前景，在一般生產中的一般褐藻膠裂解酶活性差，水解效率低，底物濃度低，不能 適應生產的要求。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是，提供一種重組褐藻膠裂解酶、其工程菌及水解制 備褐藻寡糖的方法，運用基因組文庫技術從新分離菌株VibrioSP.BZM-I中篩選高效表達 的褐藻膠裂解酶基因AlgM,構建重組的褐藻膠裂解酶基因，實現重組褐藻膠裂解酶基因在 畢赤酵母中的高效穩定表達，并利用表達的重組褐藻膠裂解酶水解較高濃度海藻酸鋼制備 褐澡暑糖。
[0007] 本發明的技術方案如下。
[0008] 內切型褐藻膠裂解酶AlgM的基因序列，其特征在于：
[0009] (1)、根據從海藻中新分離的菌株Vibrio SP. BZM-1，建立該菌的基因組文庫，篩選 得到褐藻膠裂解酶基因一AlgM ;并進行序列測定，該基因的GenBank登錄號為KM655840,該 基因編碼545個氨基酸，核屯、序列編碼521個氨基酸；
[0010] 似、根據核屯、序列設計引物：在引物的5'端分別加上接頭GTCA和GGCCA，引物序 列為：
[0011] AlgM-F ：GTCAATGAAACATAAAATCGTCAAAACATTA
[0012] AlgM-R ：GGCCATTATTTACCTTGATAGGTGCCGTG；
[001引并通過PCR擴增所述褐藻膠裂解酶基因：擴增條件為94°C3min，94°C30s， 55°C30s，72°CImin，共 30 個循環，最后 72°C3min。
[0014] 含有重組褐藻膠裂解酶基因AlgM的表達載體的構建，其特征在于：把重組褐 藻膠裂解酶基因AlgM克隆到新型畢赤酵母表達載體PHBM905BDM，首先通過PCR擴增褐 藻膠裂解酶基因AlgM序列，在dTTP保護下，用T4DNA聚合酶處理后，然后定向插入到經 CpoI和NotI雙酶切除去kan抗性基因的載體PHBM905BDM上，獲得重組質粒，命名為 I)皿M905抓M-AlgM。
[0015] 一種利用重組褐藻膠裂解酶制備的工程菌，其特征在于：保藏編號CCTCCNo: M2015500,名稱為己斯德畢赤酵母GS115/AlgM4。
[0016] 所述的工程菌水解制備褐藻寡糖的方法，其特征在于：
[0017] (1)、發酵褐藻膠裂解酶AlgM:將菌株畢赤酵母GSl15/AlgM4置于100mLBMGY培養 基中，28°C~30°C，260巧m培養40~50h，至孤6。。為20~30,于室溫離屯、5000巧m，5min， 收集菌體；
[001引 （2)、將菌體轉移至100mLBMMY培養基中，28°C~30°C，260巧m培養，每隔1化補 加甲醇；得到上清液即為粗酶液；
[0019] (3)、利用得到的粗酶液水解海藻酸鋼制備褐藻寡糖：設定水解底物的濃度 10 %~30 %，加入溫度為30~40 °C的100mL抑在8~9的堿性水做溶劑，一邊少量添加 底物，逐步遞增底物的量達到預定的量，一邊少量逐步添加粗酶液1000ul-3000ul，添加底 物和酶量比例為Ig:lOOul，均勻攬拌；保持溫度穩定在30~40°C，直至水解濃度達到每 100mL含20g海藻酸鋼；
[0020] (4)、水解完成后，將反應液進行離屯、去殘渣，取上清過濾，超濾，進行真空噴霧干 燥，得到褐藻寡糖成品。
[0021] 所述的工程菌水解制備褐藻寡糖的方法，其特征在于：底物和酶量比例為 lg:50-100ul〇
[0022] 利用所述的工程菌水解制備褐藻寡糖的方法，其特征在于：所述底物為褐藻膠、褐 藻酸和褐藻酸鹽中的一種或者任意比例的兩種W上。
[0023] 所述的工程菌的制備方法，其特征在于：
[0024] (1)、表達重組褐藻膠裂解酶的畢赤酵母工程菌的篩選：將用限制性內切酶SalI 線性化的pHBM905BDM-AlgM，轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，得到單拷貝數的重組菌株；
[0025] (2)、將獲得的單拷貝數的重組菌株接種在含有1. 0%的海藻酸鋼的平板上，從中 篩選出水解圈最大的菌株，提取該轉化子基因組；
[0026] (3)、基于Biobrick方法，將載體PHBM905BDM經過酶切和連接，得到多個拷貝表達 盒式結構串聯重復的重組質粒；
[0027] (4)、將多個拷貝表達盒式結構串聯重復的重組質粒線性化，轉化畢赤酵母GS115 感受態細胞，得到含有可控拷貝數的重組菌株；拷貝數n= 2、3、4……，n為自然數；將四拷 貝重組菌株命名為己斯德畢赤酵母GS115/AlgM4。
[0028] 本發明的積極效