一株高產細胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體設及一株高產細胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌及 其在制備抗高血壓的發酵乳品中的應用。
【背景技術】
[0002] 乳酸菌是公認的安全級微生物，廣泛應用于乳制品的發酵。牛乳是一種富含酪蛋 白而缺少游離氨基酸的環境，一些乳酸菌菌株為了適應運種特殊的生長環境，進化出一套 完整的蛋白酶系統，用來水解酪蛋白獲得游離的氨基酸W供菌體生長使用。運種蛋白酶系 統包括S個主要組分：細胞被膜蛋白酶（Cell化velopeProteinase,CE巧，寡膚轉運系統 和細胞內膚酶。其中，細胞被膜蛋白酶是催化水解酪蛋白的第一步，在整個蛋白酶系統中具 有核屯、作用，該酶在細胞內合成，經過分泌系統轉運至胞外并且錯定在菌體細胞壁上。細胞 被膜蛋白酶可W將牛乳中的酪蛋白降解為寡膚，寡膚再經由轉運系統進入細胞內被膚酶降 解為游離的氨基酸。乳酸菌細胞被膜蛋白酶的合成受到培養基中氮源的調控，當培養基中 游離氨基酸豐富時，其合成被抑制，而當游離氨基酸非常貧乏時，細胞被膜蛋白酶將大量合 成。牛乳恰好是運種游離氨基酸貧乏的環境，可W刺激特定菌株合成大量的細胞被膜蛋白 酶。
[0003] 血管緊張素轉化酶（angiotensin-convertingenzyme,ACE)可W將無活性的十膚 血管緊張素I轉變成血管收縮劑八膚血管緊張素II，同時使血管舒張九膚失活，進而使血 壓升高。通過抑制血管緊張素轉化酶的活性可W達到抗高血壓的效果。近期研究表明，來 源于牛乳的短膚具有抑制血管緊張素轉化酶的活性，進而達到抗高血壓的效果，運種短膚 被稱為生物活性膚。
[0004] 利用具有細胞被膜蛋白酶活性的乳酸菌菌株發酵牛乳是獲得生物活性膚的一種 經濟適用的方法。 陽0化]鼠李糖乳桿菌是一類較早發現并應用的益生型乳酸菌，如上世紀80年代由美國 科學家從健康人腸道中分離的鼠李糖乳桿菌LGG，該菌株能夠耐受消化道環境，并在腸道內 定殖，起到調節腸道菌群，預防和治療腹瀉，提高機體免疫力等作用。近年來，國內外對于鼠 李糖乳桿菌的研究主要集中于該菌株定殖于腸道細胞的粘附機制及其對免疫系統的調控。
[0006]目前，國外已發表的產生細胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌有分離自人陰道的鼠李 糖乳桿菌BGT10,然而因其分離生境的特定性，限制了該菌株的在食品領域的應用；此外報 道了一株產生細胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌CECT287,其發酵牛乳72小時后產物對血管 緊張素轉化酶活性最高抑制能力為47%，但由于該菌株發酵周期長且血管緊張素轉化酶活 性抑制能力居中，從而對于該菌株應用于生產具有抗高血壓的益生型發酵乳制品造成了一 定的阻礙。基于此，研發或篩選具有細胞被膜蛋白酶酶活力高，發酵周期短，產物對于血管 緊張素轉化酶活性抑制能力強的鼠李糖乳桿菌成為亟待解決的課題。
【發明內容】
[0007] 針對現有技術所述的鼠李糖乳桿菌細胞被膜蛋白酶酶活力較低，發酵周期長，產 物對于血管緊張素轉化酶活性抑制能力較弱的問題，本發明的目的是提供一株高產細胞被 膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌及其在制備抗高血壓的發酵乳品中的應用。
[0008] 本發明所述的高產細胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌，其特征在于：所述菌株命名 為鼠李糖乳桿菌化actobacillus;rhamnosus)Rl，該菌株已于2015年07月6日保藏在"中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、"，保藏號為CGMCCNo. 11055。
[0009] 上述鼠李糖乳桿菌化actobacillus;rhamnosus)Rl分離自新疆傳統發酵酸奶中， 是一株能夠在特定的化學合成培養基或原料乳中產生細胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌，具 有鼠李糖乳桿菌的典型特征，即為：革蘭氏陽性，兼性厭氧，無芽抱，不運動；菌落較小且大 小均一，邊緣整齊；細胞呈短桿狀，常3-5個成鏈；其生理生化特征是：過氧化氨酶陰性，VP 反應陰性，嗎I噪反應陰性，上述鼠李糖乳桿菌CGMCCNo. 11055的生理生化特征詳見表1。
[0010] 表1鼠李糖乳桿菌CGMCCNo. 11055的生理生化特征
[0011]
[0012]
[0013] 上述鼠李糖乳桿菌化actobaciIlus rhamnosus)RlCGMCC No.11055 生長溫度為 25-42°C，最適生長溫度為37°C。
[0014] 上述鼠李糖乳桿菌化actobacillusrhamnosus)RlCGMCCNo. 11055 在MRS培養基 中生長，靜置培養12小時后，菌體密度達到5. 32,抑值為4. 34。
[001引上述MRS培養基的配方：膜蛋白腺10.Og,牛肉膏10.Og,酵母粉5g，葡萄糖20.Og, 巧樣酸S錠2.Og,硫酸儀0. 58g，硫酸儘0. 25g，乙酸鋼3. 12g，憐酸氨二鋼1. 63g，乙酸鐘 2. 25g，吐溫-801.OmL,蒸饋水 1000血，115°C滅菌 30min。
[0016] 通過在美國生物工程信息中屯、（化tionalCenterforBiotechnology In化rmation，NCBI)查閱國際相關的基因庫，將本發明的鼠李糖乳桿菌化actobacillus rhamnosus)RlCGMCCNo. 1105516SrDNA基因序列與有關菌株的16SrDNA基因序列比較，雖 有相似性（如表2所示），但卻不完全相同，說明本發明的菌株是首次分離鑒定，具有原創 性。
[0017] 表 2 鼠李糖乳桿菌（Xactobacillus rhamnosus)R1CGMCCNo.11055 的
[0018] 16SrDNA序列與GenBank提交菌株序列相似性比較
[0019]
[0020] 上述鼠李糖乳桿菌(Xactobacillus rhamnosus)R1CGMCCNo.11055在化學合成培 養基中37°C靜置培養24小時，菌體密度可達到2. 85,抑值降至3. 95。檢測細胞被膜蛋白 酶酶活最高達到200個酶活單位每毫克蛋白。
[0021] 上述化學合成培養基配方為：葡萄糖lOg/l，乙酸鋼5g/l，憐酸二氨鐘3g/l，憐 酸氨二鐘3g/L，屯水硫酸儀0. 2g/l，四水硫酸儘0. 05g/l，屯水硫酸亞鐵0. 02g/l，丙氨酸 0.Ig/L精氨酸0.IgA,天冬氨酸0. 2g/l，天冬酷胺0. 2g/l，半脫氨酸0. 2g/l，谷氨酷胺 0. 2g/l，谷氨酸0. 2g/l，甘氨酸0.Ig/l，組氨酸0.Ig/l，異亮氨酸0.Ig/l，亮氨酸0.Ig/L， 賴氨酸0.Ig/L，苯丙氨酸0.Ig/l，甲硫氨酸0.Ig/l，脯氨酸0.Ig/L，絲氨酸0.Ig/L，蘇氨酸 0.Ig/l，酪氨酸0.Ig/L，色氨酸0.Ig/l，鄉氨酸0.Ig/l，對氨基苯甲酸0.Olg/!,D-生物素 0. 01g/l，VBl0. 001g/l，VB6 0. 002g/l，VB3 0. 001g/l，VB5 0.OOlg/l，葉酸 0. 001g/L，VB12 0.OOlg/l，VB2 0.OOlg/l，腺嚷嶺0.01邑/1，鳥嚷嶺0.01邑/1，尿喀晚0.01邑/1，黃嚷嶺0.01邑/ L，胸腺喀晚0.Olg/L，吐溫801.Oml/L，自然抑值，115°C滅菌30分鐘。
[0022] 本發明所述的高產細胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌在制備抗高血壓的發酵乳品 中的應用。
[0023] 上述鼠李糖乳桿菌化actobacillusrhamnosus)Rl在化學合成培養基或牛乳基質 中生長能產生細胞被膜蛋白酶，將其W體積比為2%~4%的量接種于原料乳中，37°C發酵 12~14小時即獲得活菌數為巧~6)Xl〇9CFU/mL的具有抗高血壓的發酵乳品。
[0024] 上述原料乳優選鮮牛乳，鮮牛乳采用己氏消毒法，在85°C保溫15秒。
[0025] 本發明公開了一株高產細胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌，有效解決了目前的細胞 被膜蛋白酶酶活力較低，發酵周期長，產物對于血管緊張素轉化酶活性抑制能力較弱的問 題，同時利用其制備的發酵乳又為現有生活提供了一種高效抑制血管緊張素轉化酶活性的 發酵乳品，實驗證實該菌株發酵原料乳12至14小時后，對于血管緊張素轉化酶活性抑制率 可達63. 1%至69. 5%之間，預示本發明所述鼠李糖乳桿菌菌株在生產抗高血壓功效的發 酵乳品方面具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0026] 本發明所述的高產細胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌已于2015年07月6日保藏在 "中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3 號）"，保藏號為CGMCCNo. 11055。
[0027] 圖 1 鼠李糖乳桿菌(Xactobacillusrhamnosus)R1CGMCCNo. 11055 在化學合成培 養基中37°C靜置培養24小時內，菌體細胞密度（0D600)和產生細胞被膜蛋白酶（CE巧的曲 線。
【具體實施方式】
[0028] 實施例 1 :鼠李糖乳桿菌化actobacillusrhamnosus)R1CGMCCNo. 11055 菌株的 篩選及生理生化特性
[0029] 將新疆傳統發酵酸奶樣品涂布在MRS培養基瓊脂平板上，倒置平板37 °C培養24小 時，挑取白色圓形且過氧化氨酶陰性的菌落，鏡檢為短桿菌，反復劃線確定純菌落，接種到 MRS培養基，顯微觀察個體形態及進行生化反應測定，最終篩選得到一株鼠李糖乳桿菌，命 名為鼠李糖乳桿菌（Xactobacillusrhamnosus)Rlo
[0030] 上述鼠李糖乳桿菌化actobacillusrhamnosus)Rl菌株為革蘭氏陽性菌，兼性厭 氧，無芽抱，不運動；菌落較小且大小均一，邊緣整齊；細胞呈短桿狀，常3-5個成鏈；其生理 生化特征是：過氧化氨酶陰性，VP反應陰性，嗎I噪反應陰性，可利用乳糖、葡萄糖、山梨糖、 薦糖、