一種睪丸酮叢毛單胞菌hy-08d的培養方法
【專利說明】-種睪丸鋼叢毛單胞菌HY-08D的培養方法
[000。（一）技術領域 本發明設及生物技術領域，特別設及一種睪丸酬叢毛單胞菌HY-08D的培養方法。
[000引仁）【背景技術】 k丙氨酸又名ka-氨基丙酸，易溶于水，微溶于乙醇，是生命體內與糖代謝密切相 關、需求量較多的氨基酸之一。近年來，隨著研究開發的不斷深入，丙氨酸在醫藥、食品及化 工等行業得到了廣泛的應用。在醫藥工業中，丙氨酸是復合氨基酸注射液和輸液的重要成 分，也是無機離子的補充劑和屯、肌功能增強劑。此外，心丙氨酸還是合成維生素Be及氨基 丙醇的重要原料。在食品工業中，心丙氨酸可W作為甜味劑和提鮮劑，改善人工甜味劑的 味感和有機酸的酸味。
[0003] k丙氨酸的生產方法由蛋白質水解提取法、發酵法逐步發展為用心天冬氨 酸-P-脫簇酶的酶轉化法(固定化細胞法或游離整體細胞法)生產。目前，我國主要采用游 離整體細胞法生產k丙氨酸。其生產過程大致如下：首先培養產k天冬氨酸-P-脫簇酶 的菌體細胞，然后將k天冬氨酸加入到培養液中，k天冬氨酸在k天冬氨酸-P-脫簇酶 的作用下轉化生成k丙氨酸，轉化完成后經過濾、濃縮、結晶、干燥等工序得到成品k丙氨 酸。酶轉化法效率的高低主要是由單位體積培養液中k天冬氨酸脫簇酶的酶活力決定的， 而提高單位體積培養液中的酶活性主要有兩種方法：一是通過菌種誘變提高菌體的產酶能 力；二是通過培養基和培養條件的優化，提高單位體積培養液中產酶菌體細胞量和單位培 養液總酶活力。
[0004] 申請人擁有游離整體細胞轉化生產k丙氨酸的專利菌株(睪丸酬叢毛單胞菌株 HY-08D，保藏編號為CGMCCNo. 6083)和技術(專利授權公告號：CN102690762B)，本發明在 原有技術的基礎上，提供一種睪丸酬叢毛單胞菌株HY-08D新的培養方法，提高單位體積培 養液中k天冬氨酸脫簇酶活力，進而提高其轉化效率。
[000引巨）
【發明內容】
本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種睪丸酬叢毛單胞菌HY-08D的培養方法， 通過提高單位體積培養液中菌體細胞濃度和k天冬氨酸-0 -脫簇酶酶量，從而提高單位 體積細胞培養液的轉化效率。
[0006] 本發明是通過如下技術方案實現的： 一種睪丸酬叢毛單胞菌HY-08D的培養方法，其特殊之處在于：包括W下步驟： (1) 菌株HY-08D斜面菌種活化：將低溫保存的菌株HY-08D接種到裝有活化培養基試 管斜面中，28-32°C培養，挑取培養好的斜面菌苔接入另一支活化用試管斜面中，28-32°C培 養，再轉接另一斜面，28-32 °C培養即得活化斜面菌種； (2) 制備菌株HY-08D-級種子液：取步驟（1)得到活化斜面菌種，接種到裝有培養基的 S角瓶中，28-32°C、進行搖床培養，得到一級種子液； (3) 制備菌株HY-08D二級種子液：取步驟（2)得到的種子液W體積比1-1. 5%。接種 量轉接到裝有培養基的發酵罐中進行擴大培養，通風比0.15-0. 25vvm，相對溶解氧濃度 20-40%，根據溶解氧需求適當調節攬拌轉速，罐壓0. 08-0. 12MPa，28-32°C，培養，得到二級 種子液； (4)制備菌株HY-08D轉化用培養液：將步驟（3)培養好的二級種子液W體積比5-10% 接種量轉接到裝有養培養基大發酵罐中進行擴大培養，控制通風比0. 10-0. 2vvm，相對溶 解氧濃度20-40%，根據溶解氧需求適當調節攬拌轉速，罐壓0. 08-0. 12MPa，28-32°C培養， 制得菌株HY-08D轉化用培養液。
[0007] 步驟（1)中，培養時間均為24-36小時。
[0008] 步驟（2)中，搖床培養時間為12-18小時，搖床轉速為180-20化pm。
[0009] 步驟（3)中，培養時間為10-16小時。
[0010] 步驟（4)中，培養時間為8-10小時。
[0011] 上述的活化斜面培養基所必需的營養物質包括（g/L):蛋白腺10 ;牛肉膏5 ;酵母 膏5 ;氯化鋼5 ;瓊脂20,pH7. 0-7. 2。
[0012] 上述菌株HY-08D培養所用培養基所必需的營養物質包括（g/L):天冬氨酸5-8 ;谷 氨酸鋼7-12 ;葡萄糖3-8 ;酵母粉5-10 ;氯化鋼3-6 ;玉米漿干粉5-12,抑6. 0-7. 0。更優 選的：天冬氨酸6-7 ;谷氨酸鋼8-10 ;葡萄糖5-6 ;酵母粉6-8 ;氯化鋼3-5 ;玉米漿干粉6-8， pH6.Oo
[0013] 上述細胞培養所用培養基是通過優化得到的，考察指標為單位體積培養液中的菌 體濃度和k天冬氨酸-0 -脫簇酶酶活力。
[0014] 上述菌株HY-05C培養的工藝控制參數(接種量、培養時間、通風量、相對溶解氧 濃度）是通過優化確定的，考察指標為轉化用培養液中單位體積的菌體濃度和k天冬氨 酸-P-脫簇酶酶活力。
[0015] 本發明所述的睪丸酬叢毛單胞菌株HY-08D來自煙臺恒源生物股份有限公司前 期選育的高產心天冬氨酸-P-脫簇酶的菌株(記載在授權號：CN102690762B，授權日： 2013. 10. 02,發明名稱為："游離細胞法生物轉化k天冬氨酸生產k丙氨酸的方法"。睪丸 酬叢毛單胞菌株HY-08D保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏編 號為CGMCCNo. 6083,保藏日期為2012年5月7日）。
[0016] 本發明的有益效果： 1、本發明通過菌株HY-08D培養基和培養條件的優化，提高了菌株HY-08D轉化用培養 液中的k天冬氨酸-P-脫簇酶酶活力，進而提高后續轉化效率和設備利用率。
[0017] 2、與原工藝相比，本發明菌株HY-08D培養工藝，通過對培養基和培養條件的優 化，單位體積培養液中菌體量較之前提高了 40%W上、天冬氨酸脫簇酶酶活力提高了 55%W 上，效果顯著。
[0018] 3、與原工藝相比，本發明菌株HY-08D培養工藝，采用S級培養，二級培養罐接種 采用1-1. 5%。的接種量，有效降低擴培次數和染菌幾率；=級培養罐采用5-15%的大接種 量，大幅縮短了培養時間，同時使得培養液中的菌體生長更加整齊，單位體積酶活力明顯增 加，轉化試驗證明，相同體積的培養液轉化效率提高60%左右。
[0019] (四）【附圖說明】 附圖1接種量對菌株HY-08D生長的影響； 附圖2接種量對菌株HY-08D產酶的影響。
[0020] (五）【具體實施方式】 下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
[00川 實施例1 一種旨在提高單位體積培養液中菌體細胞濃度和k天冬氨酸-P-脫簇酶量的睪丸酬 叢毛單胞菌株HY-08D培養方法，包括W下步驟： 1、菌種活化 將冷凍保存的菌株HY-08D接種到裝有活化培養基試管斜面中（培養基配方：氯化鋼 5g/L，蛋白腺lOg/L，牛肉膏5g/l，酵母膏5g/l，瓊脂20g/L，抑7. 0-7. 2)，30°C培養24小時， 挑取培養好的斜面菌苔接入另一支活化培養基試管斜面中，3(TC培養24小時，再轉接另一 斜面，30°C培養24小時即得活化斜面菌種。
[0022] 2、菌株HY-08D培養用培養基配制 按W下配方配制細胞培養用培養基：天冬氨酸5g/l，谷氨酸鋼lOg/l，葡萄糖5g/l，酵 母粉6g/l，氯化鋼5g/l，玉米漿干粉6g/l，將上述原料加適量水溶解，然后用氨氧化鋼調節 pH至6.0,定容，118°C下滅菌30分鐘。
[0023] 3、一級種子液的制備 取上述新鮮活化斜面菌種分別接入化的S角瓶中，培養基裝液量1000 mL, 200巧m， 30°C，搖床培養16小時，得到一級種子液。
[0024] 4、二級種子液的制備 將經上述培養獲得的一級種子液（2X1000 mL)轉接到裝有1. 5m3培養基的2m3培養 罐中，調整罐壓0. 08MPa，通風比0. 15vvm，通過調節攬拌轉速維持培養過程中相對溶解氧 20%，30°C培養12小時，得到二級種子液。
[00巧]5、轉化用培養液制備 將培養好的二級種子液（1.5m3)，轉接到裝有15m3培養基的20m3培養罐中，調整罐 壓0. 08MPa，通風比0. 15vvm，通過調節攬拌轉速維持培養過程中相對溶解氧20%，30°C培養 10小時，檢測培養液k天冬氨酸-0 -脫簇酶活力為55280U/mL。
[002引實施例2 一種旨在提高單位體積培養液中菌體細胞濃度和k天冬氨酸-P-脫簇酶量的菌株HY-08D培養方法，包括W下步驟： 1、菌種活化 將冷凍保存的菌株HY-08D接種到裝有活化培養基試管斜面中，30°C培養36小時，挑 取培養好的斜面菌苔接入另一支活化培養基試管斜面中，3(TC培養36小時，再轉接另一斜 面，30°C培養36小時即得活化斜面菌種。
[0027] 2、菌株HY-08D培養用培養基配制 按W下配方配制細胞培養培養基：天冬氨酸6旨/1，谷氨酸鋼8g/l，葡萄糖5旨/1，酵 母粉8g/l，氯化鋼4g/l，玉米漿干粉8g/l，將上述原料加適量水溶解，然后用氨氧化鋼調 節抑至6.0,定容，118 °C下滅菌30分鐘。
[002引 3、一級種子液的制備 取上述新鮮活化斜面菌種分別接入化的S角瓶中，培養基裝液量1200mL，200巧m， 30°C，搖床培養14小時，得到一級種子液。
[0029] 4、二級種子液的制備 將經上述培養獲得的一級種子液（2X1200血）轉接到裝有I. 5m3培養基的2m3培 養罐中，調整罐壓0.IMPa,通風比0. 15vvm，通過調節攬拌轉速維持培養過程中相對溶解氧 30%，30°C培養10小時，得到二級種子液。
[0030] 5、轉化用培養液制備 將培養好的二級種子液（1.5m3)，轉接到裝有15m3細胞培養培養基的20m3培養 罐中，調整罐壓0.lOMPa，通風比0.lOvvm，通過調節攬拌轉速維持培養過程中相對溶解氧 30%，30°C培養8小時，檢測培養液k天冬氨酸-0 -脫簇酶活力為58650U/mL。該培養液用 于富馬酸/天冬氨酸轉化生產。
[00引]實施例3 一種旨在提高單位體積培養液中菌體細胞濃度和k天冬氨酸-P-脫簇酶量的菌株HY-08D培養方法，包括W下步驟： 1、菌種活化 將冷凍保存的菌株HY-08D通過轉接斜面活化(培養基配方：氯化鋼5g/l，蛋白腺IOg/L牛肉膏5g/l，酵母膏5g/l，瓊脂20g/l，抑7. 0)，連續轉接S次，培養溫度30°C，培養30小 時。
[0032] 2、菌株HY-08D培養用培養基配制 按W下配方配制細胞培養培養基：天冬氨酸8g/l，谷氨酸鋼7g/l，葡萄糖3g/l，酵母粉 1〇邑/1，氯化鋼6g/l，玉米漿干粉12g/l，將上述原料加適量水溶解，然后用氨氧化鋼調節pH 至7.0,定容，118°C下滅菌30分鐘。
[0033] 3、一級種子液的制備 取上述新鮮活化斜面菌種分別接入化的S角瓶中，培養基裝液量1000 mL, 200巧m， 32°C，搖床培養18小時，得到一級種子液。
[0034] 4、二級種子液的制備 將經上述培養獲得的一級種子液（2X1000 mL)接種到到裝有1. 5m3培養基的2m3培 養罐中，調整罐壓0. 12MPa，通風比0. 2vvm，通過調節攬拌轉速維持培養過程中相對溶解氧 40%，28°C培養16小時，得到二級種子液。
[0035] 5、轉化用培養液制備 將培養好的二級種子液（1.5m3)，轉接到裝有15m3培養培養基的20m3培養罐中，調 整罐壓0. 12MPa，通風比0.Iv