一種枯草芽孢桿菌及其在溫室大棚土壤修復中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及農業微生物應用技術領域，具體地說，本發明設及一種自行選育篩選 的枯草芽抱桿菌及在溫室大棚上壤修復中應用的技術領域。
【背景技術】
[0002] 在集約農業生產中，±壤作為一個時空連續體，在精準管理時必須考慮±壤性質 的空間變異性。目前由于農民缺乏必要的施肥指導，許多農民大多根據自己的經驗進行施 肥管理，并且認為"高投入，高產出"，運導致大量盲目過量的施肥現象經常發生。然而，過量 的施肥雖然在短期內能提高作物的產量，但是，從長期來看，過量的施肥會導致±壤的生產 力下降，作物減產，同時還會導致地下水污染的危險。
[0003] 溫室大棚連續種植幾年蔬菜后，就會出現很多的問題，如±壤板結、鹽潰化、酸化， 蔬菜長勢弱、產量低、±傳病害和根結線蟲發生嚴重等。溫室大棚蔬菜生產具有高投入高 產出的特點，菜農為了獲得高產，受"施肥越多產量越高"觀念的影響，往往是盲目、超量和 不平衡施肥。而且，多數蔬菜需氮、憐、鐘的比例為1:0.4:1. 2,而實際施肥的比例多為1: 0.96 :0. 36,嚴重失調。不合理施肥造成大量化肥存積在±壤中，不僅浪費，而且還引起± 壤板結、酸化、鹽化等一系列問題，影響根系和蔬菜正常生長，引起蔬菜死棵。±壤表面長青 苔、發紅就是由于±壤中含鹽過多引起的。
[0004] 利用生物修復作用對溫室大棚±壤進行改良，必須遵循的原則，要使用適合的生 物、在適合的場所、適合的環境條件和適合的技術費用。適合的生物是溫室大棚±壤改良 的先決條件，它是指具有正常生理和代謝能力，并能W較大的速率降解和轉化污染物，并在 修復過程中不產生毒性產物的生物體系；適合的場所是指有污染物和合適的生物相接觸的 地點，污染場地不含對降解菌種有抑制作用的物質且目標化合物能夠被降解；適合的環境 條件是指環境因子包括溫度、濕度、氧氣、抑值、無機養分等；適合的技術費用是指生物修 復技術費用必須盡可能低、至少低于同樣可W消除該污染物的其他技術。目前，由于設施栽 培復種指數高，產量高，并且能夠實現一年四季均衡生產，因此，設施栽培已經成為我國農 業生產的主導產業之一。盡管有許多關于在大田中研究有機物料對±壤性質及作物產量影 響的報道，但是有關從溫室大棚±壤中分離篩選能夠改良溫室大棚±壤的菌種，W及利用 自行選育篩選馴化獲得的枯草芽抱桿菌與其他多菌種根據菌種的相融性、適用性和安全性 基本要求和菌種特性制備±壤修復劑用于改良溫室大棚±壤的研究還未見報道。
【發明內容】
[0005]針對現有技術中未見有關從溫室大棚±壤中篩選枯草芽抱桿菌作為優良菌種并 與多菌種相配伍相融合制備溫室大棚±壤修復組劑的技術現狀，本發明旨在提供一種枯草 芽抱桿菌及其用于溫室大棚±壤修復中的應用。本發明通過在溫室大棚±壤中分離出一批 微生物菌株，從中分離篩選出一株編號為X服0035KC的菌株，并通過利用編號為X服0035KC 的枯草芽抱桿菌，與巧光假單胞菌、膠凍樣芽胞桿菌和鎖擲抱酵母菌相配伍相融合制備± 壤修復組劑，有效地改良和活化±壤，降解±壤中的有害物質，解決±壤的鹽潰化問題，解 決實際設施大棚中±壤養分失衡、鹽潰化、沙化或者板結嚴重的現狀，綜合將對于蔬菜生產 的不利影響降低到最低限度，有利于提高蔬菜的產量和品質，獲得良好的技術效果，在溫 室大棚±壤修復中具有廣泛而現實的價值。 陽006] 本發明采用主要的技術方案：
[0007] 通過微生物菌種的分離篩選，在溫室大棚±壤中分離出一批微生物菌株，經過進 一步分離、篩選、選育、馴化，獲得一株編號為XHS0035KC的枯草芽抱桿菌株。通過對所獲菌 株進行形態特征、生理生化特性及16srDNA區段序列測定及系統發育分析，初步確定了其 分類地位。同時，將編號為XHS0035KC的枯草芽抱桿菌與巧光假單胞菌、膠凍樣芽胞桿菌 和鎖擲抱酵母菌相配伍相融合制備溫室大棚±壤修復組劑，按照重量份比核計，W編號為 XHS0035KC的枯草芽抱桿菌70份-80份、巧光假單胞菌20份-40份、膠凍樣芽胞桿菌25 份-45份和鎖擲抱酵母菌15份-35份進行混合，菌種混合液充分吸附于載體中，并與輔料 相混合，通過利用發酵技術制備溫室大棚±壤修復組劑。利用溫室±壤修復組劑可W改良 溫室大棚±壤的品質，有效地防治蔬菜生育期的各類病害，將溫室大棚±壤對蔬菜生產的 不利影響降低到最低限度，有效地改良和活化±壤、降解±壤中的有害物質、解決±壤的鹽 潰化問題，將±壤對果蔬生產中的不利影響降低到最低限度，有利于提高蔬菜的產量和品 質，獲得良好的技術效果，在溫室大棚上壤修復中具有現實的意義和作用。
[0008] 本發明具體提供一種枯草芽抱桿菌度acillus Subtilis),通過在溫室大棚±壤 中分離、篩選、馴化和培養，獲得一批細菌類微生物菌株，從中篩選出一株編號為X服0035KC 的菌株，經微生物學分類與鑒定，屬于枯草芽抱桿菌度acillus Subtilis)。 W09] 具體的，本發明提供菌株編號為X服0035KC的枯草芽抱桿菌度aci1Ius Subtilis)。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位：中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（CGMCC)。地址：北京市朝陽區北辰西路1號院 3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101。保藏日期是2014年7月10日，保藏號 是CGMCCNo. 9434。經微生物學鑒定為BacillusSubtilis。該菌株最適生長條件為： 溫度28°C，抑7. 2,時間4她；該菌株菌落中等且平滑，呈透明、白色、表面濕潤、邊緣整齊， 生長較快；桿狀，革蘭氏陽性，嚴格好氧，化能異養，接觸酶陽性，M.R和V-P試驗陽性， 淀粉水解陽性，明膠水解陽性，硝酸鹽還原陽性，巧樣酸鹽利用陽性；經微生物學鑒定為 BacillusSubtilis菌。依照第九版《伯杰氏系統細菌學鑒定手冊》(《Bergey,SManualof SystematicBacterio-logy》）和《常用細菌系統鑒定手冊》對XHS0035KC菌株進行形態學 測定，生理生化檢測確定XHS0035KC菌株為枯草芽抱桿菌度acillusSubtilis)中的成員。 通過BLAST同源比對，菌株XHS0035KC的16SrRNA序列在NCBI數據庫中進行BLAST分析 后，構建系統進化樹，菌株XHS0035KC與 30334-3175她acillusSubtilisKCTC1028 是其 近似種，因而根據16SrDNA序列分析結果，結合形態及生理生化特性，將菌株X服0035KC鑒 定為枯草芽抱桿菌度acillusSubtilis)。
[0010] 該菌株XHS0035KC在膜蛋白腺大豆瓊脂燈SA)培養基生長良好，經鑒定板試驗證 明XHS0035KC培養時的主要氮源包括但不限于蛋白腺、酵母粉；使用的主要碳源包括但不 限于薦糖、甘油、甘露醇、麥芽糖；使用的無機組分包括包括但不限于氯化鐘、氯化鋼、憐酸 二氨鋼、氨二鐘、憐酸=巧、二水氯化巧、屯水合硫酸儀、屯水和硫酸亞鐵。
[0011] 進一步，本發明提供一種枯草芽抱桿菌度acillusSubtilis)XHS0035KcCGMCC NO. 9434在溫室大棚±壤修復中的應用。通過利用XHS0035KC菌株制備±壤修復劑應用于 改良溫室大棚的±壤，有效地改良和活化±壤、降解±壤中的有害物質、解決±壤的鹽潰化 問題，獲得顯著良好的技術效果。
[0012] 同時，本發明具體提供一種溫室大棚±壤修復組劑的制備方法，具體制備方法步 驟如下： 陽〇1引 （1)接種：制備枯草芽抱桿菌度acillusSubtiIis)X服0035KCCGMCCNO. 9434、巧 光假單胞菌、膠凍樣芽胞桿菌和鎖擲抱酵母菌四種菌種的固體培養基，滅菌后嚴格進行無 菌操作，從斜面轉接至平板，溫度28°C下培養3天。
[0014] (2) -級培養：從步驟（1)中的固體培養基上挑取單菌落轉接至裝有液體培養基 的50血錐形瓶中，無菌操作，28°C、120r/min培養2地-4她。
[001引做二級發酵：將上述步驟一級培養菌種接種于盛有液體培養基的SOOmL錐形瓶 中，無菌操作，28°C、120;r/min培養24h-4她。
[0016] (4)菌種發酵液的配伍：按照重量份比核計，選用步驟（3)制備的枯草芽抱桿菌 度acillusSubtilis)XHS0035KCCGMCCNO. 9434二級發酵液70份-80份、巧光假單胞菌二 級發酵液20份-40份、膠凍樣芽胞桿菌二級發酵液25份-45份和鎖擲抱酵母菌二級發酵 液15份-35份進行混合，制備復合菌種的混合液。
[0017] (5)添加輔料：將步驟（4)制備的復合菌種混合液充分吸附于載體中，載體選用溫 室大棚±壤；輔料采用尿素和過憐酸巧，其中尿素與過憐酸巧的重量比為1:3 ;載體和輔料 的用量按照重量比為1:3. 5配比混合，加水至含水量40-70%，然后按體積比每立方米載體 與輔料混合用料加入上述步驟（4)制備的復合菌種混合液100-300g，并混合均勻，制備獲 得溫室大棚±壤修復組劑。
[0018] 進一步，本發明提供應用上述溫室大棚±壤修復組劑在溫室大棚中的應用。通 過利用自行篩選分離馴化獲得枯草芽抱桿菌度acillusSubtilis)XHS0035KCCGMCC NO. 9434,通過實踐與巧光假單胞菌、膠凍樣芽胞桿菌和鎖擲抱酵母菌S種菌種融合試驗， 實踐證明制備的±壤修復組劑應用于改良溫室大棚的±壤，對于改良和活化±壤、降解± 壤中的有害物質、解決±壤的鹽潰化問題，獲得顯著突出的技術效果。
[0019] 本發明進一步提供上述溫室大棚±壤修復組劑的應用方法：在空氣溫度20-30°C 下堆制；堆制是在覆蓋草簾下進行，堆制開始后每30天翻堆一次，翻堆時補水至含水量 40-70%，堆制時間持續120天；堆制完成后攤驚至干燥后即可直接施用于±壤。
[0020] 本發明所選用編號為XHS0035KC的