一種簡易的稻曲菌分離和保存方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及稻曲菌分離和保存技術領域，具體為一種簡易的稻曲菌分離和保存方法。
[0002]
【背景技術】
水稻稻曲病(Rice false smut)是由稻曲菌((Nakata) E.Tanaka & C.Tanaka)引起的一種重要的真菌病害，病菌侵染穗部后形成大于谷粒數倍的稻曲球，其表面覆蓋大量粉狀的黃色或墨綠色的厚垣孢子。稻曲球不但嚴重威脅水稻的產量和質量，且能產生對人和牲畜有劇毒作用的真菌毒素(Koiso et al., 1994; Li et al.，1995)。近些年，隨著水稻的N肥料使用量增加、雜交稻的大面積的推廣，稻曲病的發生嚴重度日益增加，在發病嚴重的年份，導致的產量損失可高達50%。
[0003]國內外研究者普遍認為稻曲菌的厚垣孢子和菌核是稻曲病發生的初侵染源，兩者通過萌發產生薄壁分生孢子直接侵染水稻。在有關稻曲病人工接種技術研究中，采用分生孢子進行注射和噴霧法接種效果更好(伏榮桃等，2015)，因此，在這些研究中成功分離和保存稻曲菌菌株是試驗成功的一個重點。稻曲菌寄生性強，腐生性弱的特點，使得分離材料稻曲球上寄生著許多其它的細菌和真菌，同時病菌在人工培養基上生長極其緩慢，因此在分離培養過程中極易被其它細菌和真菌污染(Fu et al., 2013;王永強等，2010)。
[0004]近些年來，研究者們已陸續對稻曲病原菌的分離方法進行了研究，大多采用厚垣孢子懸浮液法、稻曲球不同層組織塊分離法、菌核培養法等分離方法(周永力，1999 ;劉明霞等，2009)。以上這些方法都比較耗時，分離的成功率往往較低，且不同的報道的分離方法又有許多不一致的方面。此外，稻曲菌的室內保存方法，目前還尚未見報道。
[0005]
【發明內容】
[0006]本發明針對以上技術問題，提供種一種簡易的稻曲菌分離和保存方法，利用本發明的方法可以快速的分離到目的菌株并保存，解決了稻曲菌在分離時耗時、效率低的問題，同時也解決了菌株在保存過程中致病性退化、耗占空間等問題。
[0007]本發明的技術方案為:
一種簡易的稻曲菌分離和保存方法，該方法包括以下步驟:
I)稻曲菌菌株分離:
從發病的稻田中采集新鮮的黃色、綠色、黑色的稻曲球樣本，室溫干燥7-10d備用。從采集的樣本中挑選厚垣孢子粉覆蓋厚度大于Imm的稻曲球放在超凈工作臺上，用紫外燈殺菌30-40min ;在無菌條件下用鑷子取單粒稻曲球，輕輕震落稻曲球表面上少量的厚垣孢子粉末于PSA培養基上；用移液槍取150-200ul無菌水滴在含有厚垣孢子的PSA平板上，并用無菌的玻璃L棒將厚垣孢子均勻涂在平板上；將涂抹的平板用封口膜封口然后倒置放在28°C培養箱中，培養4-5天；用無菌解剖針挑取單個白色的或黃色的單菌落于PSA培養基上純化培養。
[0008]2)稻曲菌菌株保存:
無菌濾紙準備:將圓形濾紙剪成5-6_的方形小塊，裝入玻璃瓶中在121°C下高溫濕熱滅菌20min，然后放入干燥烘箱中烘干至含水量小于5%、備用。
[0009]將分離純化的稻曲菌菌株轉到XBZ培養基上培養5-7d ;在無菌條件下用鑷子把濾紙小塊放在培養有稻曲菌的XBZ上，每個培養皿放入6-7個濾紙小塊；將培養皿繼續放入28°C培養箱中12h光暗交替培養4-5周，直到濾紙上長有稻曲菌黃色的厚垣孢子堆；無菌條件下取出粘有黃色厚垣孢子的濾紙塊，放在超凈工作臺上風干至含水量小于5% ;將風干的濾紙塊放入無菌的4X 7cm長方形保存紙袋中，透明膠布封口 ；將裝有濾紙塊的保存袋放在無菌的牛皮紙袋中，且放入20-30粒硅膠干燥劑顆粒，封口 ；再將牛皮紙袋放入_20°C冰箱中保存備用。
[0010]3)保存菌株的活性檢測
菌株保存于_20°C冰箱后，每隔I個月在無菌條件下挑取粘有厚垣孢子濾紙片，將濾紙片上的厚垣孢子震落在XBZ培養基上；用移液槍取150ul無菌水滴在含有厚垣孢子的XBZ平板上，并用無菌的玻璃L棒將厚垣孢子均勻涂在平板上；將涂抹的平板用封口膜封口然后倒置放在28°C培養箱中，暗培養4-5天，觀察厚垣孢子單菌落的生長情況。
[0011]由于綠色和黑色的稻曲球樣本用于本申請中，其分離成功率較低，所以優選采用黃色的稻曲球標樣。
[0012]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
(一)、分離樣本稻曲球直接用紫外光殺菌，而沒用消毒劑處理，消除了消毒劑對厚垣孢子傷害作用；直接選用黃色的稻曲球作為分離樣本，黃色的厚垣孢子萌發能力強于綠色和黑色等其它顏色的厚垣孢子；本發明提供的分離方法步驟簡單，易操作，不宜受細菌污染，可重復性強，適合大數量范圍的稻曲菌菌株分離。
[0013]( 二 )、本發明提供的保存菌株方法，保存時間可達2年以上，占用空間少，適用于大數量的菌株資源保存；避免了用平板法或斜面法保存菌株每隔3-4月就會繼代一次，因稻曲菌隨著繼代次數的增加，產孢能力和致病能力就會逐漸減弱，導致保存的菌株失去原有的生物活性。
[0014]
【具體實施方式】
[0015]下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步的詳細描述。
[0016]但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于下述實施例。
[0017]實施例1:
供式培養基:
分離稻曲菌的PSA培養基:馬鈴薯300g、蔗糖15g、瓊脂10g、蒸餾水定溶至100mL^121 °C下高溫濕熱滅菌40min，待培養基冷卻到不燙手的溫度45 ± 3°C時加入抑制雜菌生長氯霉素100 μ gml 1混勻，倒入培養皿中備用。
[0018]保存稻曲菌的XBZ培養基:馬鈴薯300g、蔗糖20g、Na2HPO4.12H20 2g、Ca(NO3)2.4H20 0.5g、蛋白胨5g、瓊脂10g、蒸餾水定溶至1000mL，在121°C下高溫濕熱滅菌30min，冷卻備用。
[0019]I)稻曲菌菌株的分離和純化
(I)稻曲菌菌株的分離:2012年8月中旬從四川發病的稻田中采集新鮮的黃色稻曲球樣本228個，室溫干燥7-10d備用。從采集的樣本中挑選厚垣孢子粉覆蓋厚度大于Imm的稻曲球放在超凈工作臺上，用紫外燈殺菌30min ;在無菌條件下用鑷子取單粒稻曲球，輕輕震落稻曲球表面上少量的厚垣孢子粉末于PSA培養基上；用移液槍取150ul無菌水滴在含有厚垣孢子的PSA平板上，并用無菌的玻璃L棒將厚垣孢子均勻涂在平板上；將涂抹的平板用封口膜封口然后倒置放在28°C培養箱中，培養4-5天；用無菌解剖針挑取單個白色的或黃色的單菌落于PSA培養基上培養15d。實驗證明通過以上方法分離稻曲菌菌株的成功率可達100%。
[0020](2)稻曲菌菌株純化:挑取培養好的稻曲菌菌絲片，用長有氣生菌絲的一面與PSA平板表面摩擦畫線，不斷稀釋菌絲表面產生的分生孢子直至能長出單個菌落，然后放置平板于28 °C培養箱中，暗培養4-5天。
[0021]2)稻曲菌菌株保存:
無菌濾紙準備:將圓形濾紙剪成5-6_的方形小塊，裝入玻璃瓶中在121°C下高溫濕熱滅菌20min，然后放入干燥烘箱中烘干至含水量小于5%、備用。
[0022]挑取上述純化后的單菌落于XBZ固體培養基上培養5-7d ;在無菌條件下用鑷子把濾紙小塊放在培養有稻曲菌的XBZ固體培養基上培養上，每個培養皿放入6-7個濾紙小塊；將培養皿繼續放入28 °C培養箱中，12h光