官能化的多肽的制作方法
【專利說明】官能化的多肽
[0001] 本申請是2009年6月30日提交的同名發明專利申請200980124781. 2的分案申 請。
[0002] 【相關申請】
[0003] 本申請要求提交于2008年6月30日的題為〃Methods And Compositions For Modifying Immunobinders〃的美國臨時申請No. 61/076, 775的優先權，將其內容通過引用 整體并入本文。 【【背景技術】】
[0004] 治療性多肽的功效常大大受限于它們固有的藥代動力學性質。例如，治療性抗體 的情況中，組織滲透，組織停留及血清半衰期的問題常被報道。治療性多肽的藥代動力學性 質的改善可導致改善的功效及減少的劑量方案。調節治療性多肽的藥代動力學性質的現有 方法一般限于解決血清半衰期的問題。而且這些方法一般涉及耗時或既有多肽的非特異性 化學改變。
[0005] 因此，本領域中有對提供氨基酸修飾的快速及特異手段，及除了半衰期之外，也獲 得藥代動力學參數的調節治療性多肽的藥代動力學性質的改良的方法的需求。
[0006] 【發明概述】
[0007] 本發明提供官能化的多肽，尤其是治療性多肽（例如，scFv)。本發明的多肽包括 可通過添加一個或官能部分（例如，PEG)和/或結合特異性（例如，有特定結合特異性的 氨基酸序列）來快速及特異性地官能化的接頭序列。所述官能化的多肽的優點在于，相比 非官能化的多肽具有改善的藥代動力學性質（例如，改善的體內半衰期，組織滲透及組織 停留時間）。還提供了快速及可再現產生官能化的多肽的方法。
[0008] 因此，一方面，本發明提供多肽，例如免疫結合子（例如scFv)，包括通過氨基酸接 頭連接的2個結構域。接頭通常包括能形成鏈內二硫鍵的2個半胱氨酸，及當2個半胱氨 酸通過二硫鍵彼此鍵合時，這2個半胱氨酸之間的接頭序列中的氨基酸形成環。特定實施 方式中，接頭包括SEQ ID N0 :1或2所示的序列。
[0009] 某些實施方式中，接頭含結合靶分子，例如PK修飾劑（例如，透明質酸，及血清白 蛋白）的環。通過結合到靶分子，包括多肽的接頭的血清半衰期和/或滲透進組織的功效 和/或特定結合特異性增強。特定實施方式中，接頭包括SEQ ID N0 :3或4所示的氨基酸 序列。優選實施方式中，多肽包括SEQ ID N0 :6或8所示的氨基酸序列。
[0010] 某些實施方式中，接頭中的至少一個半胱氨酸殘基共價連接到官能部分。特定實 施方式中，接頭中的2個半胱氨酸殘基共價連接到相同的官能部分。適宜官能部分包括，例 如，PEG，碳水化合物分子及羥乙基淀粉（HES)。將官能部分例如PEG或HES共價連接到多 肽之后，所述多肽在受試者中的半衰期延長。
[0011] 另一實施方式中，本發明提供包括本發明的一或多種多肽及藥學可接受的載質的 組合物。
[0012] 其他實施方式中，本發明提供編碼本發明的多肽的核酸分子（例如載體），及含所 述核酸分子的宿主細胞。
[0013]另一實施方式中，本發明提供生產官能化的多肽的方法。所述方法通常包括：提供 肽序列庫，從庫中鑒定結合靶分子的至少一種肽序列，及修飾含接頭的多肽的環區，以包括 鑒定的至少一種肽序列。期望的肽序列可通過任何本領域已知的方法鑒定，包括，例如，噬 菌體展示，酵母展示，或mRNA展示。 【【附圖說明】】
[0014] 圖1示各種處理的ESBA105分子的SDS-PAGE (泳道3~10)。泳道1:標記物；泳道 2 :未標出；泳道3 :用DTT還原的；泳道4 :還原的及透析的；泳道5 :還原的，半胱氨酸-聚 乙二醇化的；泳道6 :半胱氨酸-聚乙二醇化的，透析的；泳道7 :對照；泳道8 :賴氨酸-聚 乙二醇化的；泳道9 :賴氨酸-聚乙二醇化的，透析的；泳道：10,對照。PEG的分子大小約為 0.7kDa/PEG〇
[0015] 圖2顯示（A)半胱氨酸-聚乙二醇化的ESBA105及⑶賴氨酸-聚乙二醇化的 ESBA105的TNF a結合活性的ELISA分析。A :對于ESBA105的EC50為0, 9833 ;對于還原的 ESBA105 :1，291 ;及對于 Cys 聚乙二醇化的 ESBA105 :1，164。對于 ESBA105 的 R2為 0,9814 ; 對于還原的 ESBA105 :0,9891 ;Cys 聚乙二醇化的 ESBA105 :0,9857。8:對于 ESBA105 的 EC50 為0,8073，及對于1^8聚乙二醇化的￡584105:1，326。對于￡584105的妒為0,9870，及對 于聚乙二醇化的ESBA1050, 9640。
[0016] 圖3顯示（a)未修飾的，氧化的ESBA105-SS-接頭的示意圖，（b)使用單官能PEG 化劑1聚乙二醇化的ESBA105-SS-接頭（ESBA105-S 2-PEG2)，及（c)使用雙官能PEG化劑2 聚乙二醇化的 ESBA105-SS-接頭（ESBA105-S2-PEG)。
[0017] 圖4顯示：⑷ESBA105及ESBA105-SS-接頭的TNF a結合活性的ELISA分析；（B) ESBA105的SDS-PAGE凝膠經歷各種處理；及（C)使用兔抗-PEG抗體蛋白印跡評定ESBA105 及ESBA105-SS-接頭的聚乙二醇化程度。圖4(B):泳道1 :還原的+透析的+上限濃縮 的ESBA105SS接頭；泳道2 :還原的+透析的ESBA105SS接頭；泳道3 :還原的+聚乙二醇 化的ESBA105SS接頭；泳道4 :還原的+聚乙二醇化的+透析的ESBA105SS接頭；泳道5 : ESBA105SS 接頭。
[0018] 圖5顯不圖不以菌體展不的目的在菌體2表面上的scFv分子1的肽環的展 現（scFv分子及噬菌體不成比例）的示意圖。圖示的情況中，環包括可與靶分子3,例如血 清白蛋白（半衰期延長），FcRx(胎盤轉運），粘蛋白（上皮停留時間延長），整聯蛋白（RGD 肽），補體，緊密連接蛋白，多聚化，等相互作用的7個氨基酸。
[0019] 圖6顯示ESBA105及半胱氨酸-聚乙二醇化的ESBA105-SS-接頭的TNFa結合 活性的ELISA分析。對于ESBA105的EC50為0, 9980;及對于有聚乙二醇化的SS接頭的 ESBA105 :1，181。對于ESBA105的R2為0,9397 ;及對于有聚乙二醇化的SS接頭的ESBA105 : 0, 9851。
[0020] 圖 7a顯示ESBA903 的 VEGF結合動力學。Fit :1:1 結合；ka(I/Ms) :7,68E+5 ;kd(l/ s) :4,310E-5;KD(M) :5,608E-11。圖 7b 顯示 ESBA903-P 印 1 的結合動力學。Fit:l:l 結合； ka(I/Ms) :1. 133E+6;kd(l/s) :5,026E-5。對于7a及7b兩者，X軸的值以秒給出，Y軸的值 以共振單位（RU)給出。
[0021] 【發明詳述】
[0022] 【定義】
[0023] 術語〃結構域〃，對于多肽，取本領域認可的意義，及指獨立的三級結構單元。結構 域之例包括但不限于抗體VH或VL結構域，纖連蛋白結構域及錨蛋白-重復結構域。
[0024] 術語〃接頭〃是指連接2個結構域的線性氨基酸序列。本發明的接頭可遺傳和/ 或化學融合到結構域。某些實施方式中，接頭含環。
[0025] 術語〃環〃是指由接頭內鏈內二硫鍵形成的環狀氨基酸序列。
[0026] 術語〃聚乙二醇〃或〃PEG〃是指有化學式H0-(CH2CH 20)n-H的線性或分支的中 性聚醚，及其反應性衍生物。反應性PEG衍生物為本領域熟知，及包括但不限于偶聯于 甲基-PE012-馬來酰亞胺，N-羥基湖泊酰亞胺碳酸酯，N-羥基湖泊酰亞胺丙酸酯，p-硝 基苯-碳酸酯，苯并三唑-碳酸酯，及醛的PEG。特定實施方式中，氨基-反應性PEG衍 生物是能與二硫鍵特異反應的雙 -砜-偶聯的PEG(見例如，Brocchini et a\，Nature Protocols, 2006:1 (5)，241)。適宜 PEG 分子的分子大小在 0, 5kDa 及 50kDa 之間。
[0027] 術語〃靶分子〃是指被本發明的多肽環區特異結合的任何分子。靶分子，包括，例 如，糖類，蛋白及脂類。
[0028] 術語〃官能部分〃是指給其所連接的分子（例如PEG分子，一或多個碳水化合物 分子或羥乙基淀粉（HES))附加額外的官能性的生物或化學實體。
[0029] 術語"PK修飾物"是指當結合到蛋白時改變蛋白的藥代動力學性質的任何分子。 PK修飾物一般（但不必需）是存在于受試者（例如患者）的天然存在的，內源性分子。所 述PK修飾物在受試者內的定位及豐度可為生理或病理的（例如在癌細胞表面，或在發炎 位點過表達）。適宜PK修飾物包括，例如，透明質酸，II型膠原，血清白蛋白，抗體Fc受體 (例如，FcRx)，抗體Fc區，粘蛋白，整聯蛋白，緊密連接蛋白，轉鐵蛋白，及補體因子。
[0030] 術語〃修飾的〃或〃修飾"，對于多肽的氨基酸序列，是指添加氨基酸到多肽序列 或置換多肽序列中既有的氨基酸。適宜于修飾多肽的氨基酸包括全部已知的天然氨基酸， 非天然氨基酸，及其官能化的衍生物（見例如，美國專利7, 045, 337及7, 083, 970,將其通過 引用整體并入本文）。
[0031] 術語"免疫結合子"是指含抗體抗原結合位點的全部或部分（例如，重鏈和/或輕 鏈可變區的全部或部分）的分子，從而免疫結合子特異性地識別靶抗原。免疫結合子的非 限定例包括全長免疫球蛋白分子及scFv，以及抗體片段，包括但不限于（i)Fab片段，由\， VH，（^及C HI結構域構成的單價片段；（ii