抗生素difluostatin A及其制備方法和在制備抗菌藥物中的應用
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于工業微生物領域，具體涉及新的抗生素difluostatin A及其制備方法 和在制備抗菌藥物中的應用。
【背景技術】：
[0002] Fluostatins類化合物結構多樣且具有多種生物、藥理活性。一些化合物有很強的 細胞毒或抑菌活性，有很好的應用前景。
【發明內容】
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[0003] 本發明的第一個目的是提供一種新的具有抗菌活性的fluostatin類二聚體化合 物 difluostatin A〇
[0004] 本發明的一種新的fluostatin類二聚體化合物difluostatin A，其結構如式（I) 所示：
[0005]
[0006] 本發明的第二個目的是提供fluostatin類二聚體化合物difluostatin A的制備 方法。
[0007] 本發明的化合物difluostatin A是從天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor. )YFll-3的發酵培養物中制備分離得到的。
[0008] 本發明優選通過以下方法從天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor. )YF11_3 的發酵培養物中制備得到化合物difluostatin A，具體步驟如下：
[0009] a、制備天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor. )YF11_3的發酵培養物，將該發 酵培養物的發酵液和菌絲體分離開，發酵液經大孔樹脂吸附，后用丙酮洗脫大孔樹脂，洗脫 液回收丙酮后剩余的水混合液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層經蒸餾濃縮后得到浸膏A ;菌 絲體先用丙酮浸提，浸取液回收丙酮后剩余的水混合液再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層經 蒸餾濃縮后得到浸膏B ;
[0010] b、將浸膏A和浸膏B合并的粗提物經硅膠柱層析，用氯仿/甲醇作為洗脫劑，從 體積比100 :〇~0 :1〇〇進行梯度洗脫，收集氯仿/甲醇體積比95 :5梯度洗脫下來的餾分 Fr. 2,后經0DS反相中壓液相色譜，用水/甲醇作為洗脫劑，從體積比100 :0~0 :100進 行梯度洗脫，收集水/甲醇體積比20 :80梯度洗脫下來的餾分Fr. 2-7,再過LH-20凝膠柱， 以氯仿/甲醇體積比1:1作為流動相洗脫，洗脫餾分再經薄層層析純化分離，得到化合物 difluostatin A〇
[0011] 所述的a)步驟的制備天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor. ) YF11-3的發 酵培養物優選通過以下方法制備：將活化的天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor.) YF11-3接入種子培養基，28°C，200rpm，培養48h得種子液，將種子液以10 %的接種量接入 到發酵培養基中，28°C，200rpm，振蕩培養120h，而制得發酵培養物，所述的種子培養基的配 方為每升培養基中含有：淀粉l〇g，酵母粉5g，蛋白胨4g，CaC0 3 2g，粗海鹽30g，余量為水， pH 7. 2 ;所述的發酵培養基的配方為每升培養基中含有淀粉10g，魚蛋白胨lg，玉米粉6g， 細菌蛋白胨2g，甘油5ml，CaC0 3 2g，粗海鹽30g，余量為水，pH 7. 0。
[0012] 本發明的第三個目的是提供天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor.) YF11-3在制備化合物difluostatin A中的應用，所述的天藍色鏈霉菌（Streptomyces. coelicolor. )YFll-3是通過將載體pSET152片段置換到含有fluostatins的生物合成基因 簇的cosmid上，然后轉化進天藍色鏈霉菌（Streptomyces. coelicolor. )YF11中而得到的， 所述的fluostatins的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] 本發明人通過實驗發現，化合物difluostatin A對Klebsiella pneumonia ATCC 13883, Aeromonas hydrophila ATCC 7966, Staphylococcus aureus ATCC 29213 和 Enterococcus faecalis ATCC 29212 有生長抑制活性，其中對 Klebsiella pneumonia ATCC 13883， Aeromonas hydrophila ATCC 7966， Staphylococcus aureus ATCC 29213 的 MIC值分別是4 y g mL y g mL 1和8 y g mL i。因此，本發明的第四個目的是提供化合物 difluostatin A在制備抗菌藥物中的應用。
[0014] 所述的抗菌藥物優選為抗肺炎克雷伯菌、嗜水氣單胞菌或金黃色葡萄球菌的藥 物。
[0015] 本發明的第五個目的是提供一種抗菌藥物，其特征在于，包含有效量的化合物 difluostatin A作為活性成份。
[0016] 所述的抗菌藥物優選為抗肺炎克雷伯菌、嗜水氣單胞菌或金黃色葡萄球菌的藥 物。
[0017] 本發明從天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor. )YF11_3分離得到1個新的 具有抗菌活性的fluostatin類化合物difluostatin A，其能用于制備抗菌藥物，通過生物 工程或化學修飾可望開發成為抗菌新藥。
[0018] 所述的天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor. )YF11_3通過以下方法制備：
[0019] 一、Fluostatins及其相關化合物產生菌小單孢菌SCSI0 N160基因組DNA的提取
[0020] 將新鮮小單孢菌SCSI0 N160的菌絲體按照5 %的接種量接種于50mL的1#培養 基（淀粉1(^，酵母粉48，細菌學蛋白胨28，海鹽1(^，加水定容至11，口117.2-7.4)中， 28-30°C，振蕩培養約2-3天，4000rpm離心10分鐘收集菌絲體。菌絲體用STE溶液（NaCl 75mM，EDTA 25mM，Tris-Cl 20mM)洗滌兩次，向洗滌后的菌絲體中加入30mL STE溶液和終 濃度3mg/mL的溶菌酶，渦旋均勻，37°C溫浴3小時，加入至終濃度0. 1-0. 2mg/mL的蛋白 酶K，混勻，37°C溫浴10分鐘，加入至終濃度1-2%的SDS，混勻，放入55°C水浴約1小時， 期間顛倒數次。加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（V/V/V = 25:24:1)，混合均勻，置于冰 上冷卻30分鐘。12000rpm，4°C離心10分鐘，然后用剪過的大口徑槍頭小心吸取上清到新 的離心管中，用同樣的方法反復處理3次，然后用等體積的氯仿洗滌兩次，12000rpm，4°C離 心10分鐘。用剪過的大口徑槍頭將水相吸出轉移至新的離心管，加入1/10體積3mol/L NaAc (pH5. 2)，混勻后再加入等體積的異丙醇，混勻后冰上放置，沉淀DNA。小心地用玻璃棒 將DNA纖維團轉移至新的離心管中，用70%乙醇洗滌兩次，將液體傾出，在37°C下略微烘 干，加5mL TE溶解，并加入3-5U的RNA酶，由此得到小單孢菌SCSIO N160基因組DNA。
[0021] 二、Fluostatins生產菌小單孢菌SCSION160基因組文庫的建立
[0022] 首先通過一系列的稀釋實驗來確定限制性核酸內切酶Sau3A I的用量，在20 y L 體系中，含有17 y L的小單孢菌SCSIO N160基因組DNA，2 y L的10 X反應緩沖液和1 y L不 同稀釋度的Sau3A I，其終止反應為4yL 0. 5mol/L EDTA和合適的上樣緩沖液。通過摸索 確定了 〇. 025-0. 05U的酶活單位比較合適。在此基礎上通過大量部分酶切得到30~42kb 的基因組DNA片段，用去磷酸化酶進行去磷酸化處理。
[0023] 用于構建文庫的載體SuperCos 1質粒先用限制性核酸內切酶Xba I從兩個cos序 列中間切開，然后進行去磷酸化處理，再從多克隆位點處用限制性核酸內切酶Bam HI切開， 獲得兩個臂。處理后的載體與之前制備的部分酶切的30~42kb的基因組DNA片段連接過 夜，連接體系為10 y L，含有1. 25 y g制備的基因組DNA片段和0. 5 y g處理后的SuperCos 1質粒，1 y L的10 XBuffer，0. 3U的連接酶。連接產物于65°C處理15分鐘，使連接酶失 活。從-80°C冰箱中取出一管包裝混合物（50 yL)置于冰上，將包裝混合物在指間迅速融 化，小心吸取一半包裝混合物（25 yL)至一個新的離心管中，加入10 yL熱處理后的連接產 物，其余包裝混合物于-80°C保存。小心混勻，30°C溫浴90分鐘，加入另外一半包裝混合物 (25 y L)，30°C溫浴繼續90分鐘。加入500 y L噬菌體稀釋緩沖液（100mmol/L NaCl，lOmmol/ L MgCl2，10mmol/L