一種以流感病毒為載體的hcv核酸檢測用質控品及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于HCV核酸檢測領域，特別涉及一種以流感病毒為載體的HCV核酸檢測 用質控品及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 丙型肝炎病毒（h印atitis C virus，HCV)是一種經血液傳播的RNA病毒，可以引 發各種慢性肝病，其中包括肝硬化和肝細胞癌。據世界衛生組織統計，全球HCV的感染率約 為3%，估計約1. 7億人患有慢性丙肝，每年新發丙型肝炎病例約3. 5萬例。我國是HCV慢 性感染率高發國家之一，約有3800萬HCV感染者。HCV慢性感染導致肝臟發生慢性炎癥壞 死和纖維化，部分患者可能發展成肝硬化乃至肝癌，可嚴重影響生命健康。因此，對其進行 快速、準確、有效的檢測至關重要。
[0003] 實時熒光定量RT-PCR因其靈敏度高、特異性強、重復性好、定量準確與高通量等 優點，已逐步成為HCV檢測的一線方法，廣泛用于疾病的早期診斷、病情估計、指導用藥和 療效監測中。
[0004] 實時熒光定量RT-PCR包括樣本核酸提取、RNA逆轉錄為cDNA、cDNA擴增和產物分 析四個步驟，檢測過程較為復雜，容易受到多種因素的影響。這些因素可能源自于樣本自 身，如標本中血紅素、肝素、尿素等干擾物質會對PCR反應產生抑制作用。也可來源于人為 因素，如實驗人員操作失誤造成樣本核酸抽提質量不佳或者核酸丟失，可導致靶值偏低乃 至假陰性結果。另外，保存、運輸環境中RNA酶和溫度等因素引起的病毒核酸降解也不容忽 視。因此，核酸擴增實驗中必須采用嚴格的質量控制措施，需要特定的陽性質控品防止假陰 性結果，這對于保證核酸檢測結果的準確、可靠具有重要的意義。
[0005] 目前HCV核酸檢測用質控品主要有以下幾種：裸露的RNA、陽性病人血清或血漿、 人工制備的假病毒顆粒。裸露的RNA由cDNA經體外轉錄得到，極易被環境中的核糖核酸酶 (RNase)所降解而難于長期保存，且其不參與核酸抽提過程，因而不能反映病毒的提取效 率。陽性病人血清或血漿相對穩定，可對標本核酸提取及反轉錄過程進行監測，但因其有潛 在生物安全性、樣本來源有限等問題限制了其在臨床檢測中的應用。為此，相關政府職能部 門鼓勵生產廠家研發人工合成質控品以替代上述質控品。
[0006] 近些年來國內外學者進行了大量探索，當前最具代表性的就是Armored RNA技術 制備的假病毒顆粒。它利用MS2噬菌體衣殼蛋白自我組裝的特性，采用原核表達技術將特 定病毒RNA包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內得到帶有檢測靶標的噬菌體樣顆粒。噬菌體顆 粒RNA由衣殼蛋白保護，能夠抵抗核酸酶及各種理化環境因素，具有穩定性好、無生物傳染 隱患、可全程監測核酸檢測過程等特點，因而解決了傳統HCV RNA質控品自身存在的一些問 題。目前已有研究機構利用此技術平臺人工合成能模擬臨床標本的HCV質控品，在HCV臨 床分子診斷中展示了較好的應用前景。
[0007] 然而，Armored RNA技術生產的噬菌體病毒顆粒在實際應用中仍存在一些不足。 首先，在國外Armored RNA技術因專利保護問題導致商品化質控品價格昂貴（http:// asuragen. com/)，非普通臨床檢驗實驗室所能承擔，這大大限制該產品的臨床應用。而在 國內，因缺失相應的產品標準和質量管理規范，目前尚未有Armored RNA技術制備的商品 化HCV質控品，僅有部分機構自行制備，質控品質量不能得到有效保證。其次，對于有包膜 RNA病毒，如HCV，其包膜為脂質雙分子層，與噬菌體顆粒表面堅固的衣殼蛋白結構不同，使 用衣殼蛋白噬菌體不能準確反映樣本處理檢測過程中的變化，因而不能簡單地使用衣殼病 毒噬菌體作為此類病毒檢測中的質控品。因此，理想質控品的制備應需符合相應質量管理 標準，還應與檢測對象具有相同的生物學特性，這對于確保HCV核酸檢測的可信性具有重 要意義。
[0008] 病毒學研究近些年獲得了巨大發展，如流感病毒反向遺傳學技術。特別是 Hoffmann等建立的8質粒反向遺傳操作系統，利用同一質粒模板同時生成流感病毒的vRNA 和mRNA，共轉染293T細胞后可成功拯救得到流感病毒。相比之前拯救系統，8質粒系統大 大減少了質粒的使用數量，從而顯著提高了病毒拯救效率。該技術使得人們可以對病毒基 因直接進行修飾，按預期計劃獲得目標重配病毒，目前已廣泛用于病毒基因組結構與功能、 病毒的轉錄表達和致病機制研究，侯選疫苗毒株的研制等方面。
[0009] 當前，已有大量關于流感病毒作為外源基因載體用于基因治療和傳染病防控等方 面的報道，如流感嵌合副流感、衣原體、結核桿菌、呼吸道合胞病毒、艾滋病毒和腫瘤等。但 目前國內外尚無流感病毒作為載體用于質控品方面的報道。因此，利用流感反向遺傳技術 拯救含有HCV保守目的基因的突變流感病毒，然后參考流感疫苗生產過程制備HCV質控品 將是核酸檢測用質控品研究領域新的里程碑。從病毒檢測診斷角度看，流感病毒自身即是 脂質雙分子層包裹內部核酸，它真實反映了 HCV的結構特性，比外裹衣殼蛋白的噬菌體更 能反映HCV及其在樣本中的真實情況。同時，質控品的制備模擬流感疫苗的生產及其質量 控制要求，這些均有相應的國家標準（參見中國藥典中"流感全病毒滅活疫苗"相關內容）。 因此，流感病毒為載體的HCV質控品可以最大程度模擬真實病毒核酸檢測過程，包括同樣 的特異性和靈敏度，真正實現對HCV核酸檢測的全方位監測，對于保證HCV RNA檢測結果的 準確可靠具有重要的實際應用價值。
【發明內容】
[0010] 本發明所要解決的技術問題是提供一種以流感病毒為載體的HCV核酸檢測用質 控品及其制備方法，該質控品可真實模擬HCV病原體，實現對HCV檢測的全方位監測；易于 大規模制備，降低成本，穩定性好，易于保存和運輸，具有良好的應用前景。
[0011] 本發明的一種以流感病毒為載體的HCV核酸檢測用質控品，所述質控品由攜帶 HCV保守基因的重組流感病毒經擴大培養滅活純化而得。攜帶HCV基因的重組流感病毒能 通過病毒拯救方法在細胞內進行拯救，并能在雞胚中大量擴增。
[0012] 所述流感病毒載體為（A/Puerto Rico/8/34)PR8病毒，也可以是其他亞型流感病 毒骨架。
[0013] 所述HCV保守基因插入的基因片段為PR8病毒基因組的NS基因（編碼流感病毒 NS1和NEP蛋白的RNA片段8,序列信息詳見GeneBank，序列號：AF389122)。
[0014] 所述HCV保守基因為HCV 5' UTR，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示（序列信息 詳見 GeneBank，序列號：AF176573)〇
[0015] 所述攜帶HCV保守基因的重組流感病毒的NS基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 示。自5'到3'端序列依次為：PR8病毒NS基因的5'非編碼區，NS1蛋白編碼區（缺失NS1 終止密碼子），GSG linker序列，HCV 5'UTR的反向互補序列，GSG linker序列，豬捷申病 毒（porcine teschovirus - 1，PTV-1)的2A肽序列，NEP蛋白編碼區，PR8病毒NS基因的 3'非編碼區。
[0016] 本發明的一種以流感病毒為載體的HCV核酸檢測用質控品的制備方法，包括：
[0017] (1)構建用于流感病毒拯救的在PR8病毒NS基因上插入HCV保守基因的質粒；
[0018](2)將上述構建好的質粒，與分別轉錄表達PR8病毒PB2 (AF389115)、 PB1 (AF389116)、PA(AF389117)、HA(AF389118)、NP(AF389119)、NA(AF389120)、M(AF389121) 的質粒共轉染293T細胞，拯救獲得攜帶HCV 5' UTR的重組流感病毒；
[0019] (3)將上述重組流感病毒進行擴大培養、滅活、純化，制備成HCV核酸檢測用質控 品（參照中國藥典中"流感全病毒滅活疫苗"相關內容）。
[0020] 有益效果
[0021] (1)易于大規模制備，降低成本。因重組流感病毒在雞胚中生長良好，參照流感全 病毒滅活疫苗生產工藝，2~3天即可獲得高濃度病毒粒子，從而實現批量生產供應，顯著 降低質控品成本。
[0022] (2)穩定性好，易于保存和運輸。由于基因組RNA包裹在流感病毒包膜蛋白內，因 而具有耐RNase的特點，可避免被外界環境中RNase降解。室溫條件下可保存一個月，4°C 可保存至少8個月，作為質控品具有良好的穩定性。
[0023] (3)無生物傳染性，安全可靠。質控品成品經甲醛滅活，在雞胚中經滅活驗證無傳 染性，不會對環境造成污染，也不會對臨床實驗室人員造成危害。
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