轉基因水稻pa110-15外源基因純合雜合狀態的pcr檢測引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種轉基因水稻外源基因插入的純合/雜合狀態檢測的方法，特別涉 及轉基因水稻PA110-15外源基因純合雜合狀態的PCR檢測引物及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 標準物質是食品、農產品中轉基因成分檢測的"金標準"，是依法開展轉基因生物 安全監管的重要物質基礎。轉基因成分檢測標準物質研制對原材料的均勻性、穩定性、特征 量值范圍等方面有嚴格要求。目前，國內外轉基因成分檢測普遍采用基于核酸的定性、定量 檢測方法。其中定量檢測通常采用Real Time-PCR方法對樣品中靶標核酸序列進行絕對定 量，即測定外源DNA插入特征序列的拷貝數，并以此為基礎計算樣品中轉基因成分的含量。 在轉基因成分檢測中，可以將外源DNA看作一個基因座位，一個純合體的2倍體基因組中檢 測靶標核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷貝數為2, 一個雜合體的2倍體基因組中外 源DNA插入特征序列的拷貝數為1，非轉基因材料中則為0。因而，轉基因檢測標準物質制 備原材料的均勻性、穩定性、特征量值范圍主要體現在外源DNA插入所產生的特征序列的 雜合或純合狀態。在標準物質的研制過程中，必需對原材料中靶標核酸序列的遺傳特性進 行確認，即確認外源DNA插入所產生的特征序列是純合還是雜合狀態。
[0003] 此外，在轉基因作物遺傳育種過程中，往往需要將轉基因材料與其它材料進行雜 交、轉育以獲得適合的栽培品種，利用分子生物學手段快速、簡便鑒定純合體/雜合體育種 材料，也有利于縮短育種進程。
[0004] 目前，已報道的轉基因成分檢測方法，主要包括針對外源目的基因、調控元件的篩 選檢測和基因特異性檢測，針對遺傳轉化載體構建特征的構建特異性檢測，針對外源DNA 插入特征序列的品系特異性檢測等三類。利用以上方法，只能確定樣品中是否含有轉基因 成分或含有何種轉基因成分，但無法直接鑒別樣品中外源DNA插入的純合或雜合狀態。迄 今未止，國內外目前還沒有針對轉基因水稻PA110-15外源基因純合/雜合狀態的檢測方 法。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供檢測轉基因水稻PA110-15外源基因插入的純合/雜合狀 態的PCR檢測引物。
[0006] 本發明的目的還在于提供轉基因水稻PA110-15外源基因插入的純合/雜合狀態 的PCR檢測方法。
[0007] 本發明的目的還在于提供轉基因水稻PA110-15外源基因插入的純合/雜合狀態 的PCR檢測試劑盒。
[0008] -種轉基因水稻PA110-15外源基因純合雜合狀態的PCR檢測引物，所述引物為： PA110-LA-F，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示；PA110-LA-R，其核苷酸序列如序列 表 SEQ ID No. 2 所示。
[0009] 專利CN201410081893公開的了轉基因水稻PA110-15外源插入片段旁側序列及應 用。本發明根據PA110-15外源插入片段旁側序列信息，在水稻染色體部分設計出一對能夠 準確檢測轉基因水稻PA110-15外源基因插入的純合/雜合狀態的PCR檢測引物。
[0010] 一種轉基因水稻PA110-15外源基因純合雜合狀態的PCR檢測方法，按照如下步驟 進行：
[0011] (1)提取待檢測水稻樣品的DNA ;
[0012] (2)以提取的DNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列為擴 增引物，建立PCR擴增體系并進行PCR擴增；
[0013] (3)如果僅擴增出一條3856bp片段，則待檢測的樣品為純合轉基因水稻 PA110-15 ;如果擴增出3856bp和751bp的兩條片段，待檢測的樣品為雜合轉基因水稻 PA110-15 ;如果只擴增出一條751bp片段，待檢測的樣品為非轉基因水稻。
[0014] 其中，所述的從待檢測水稻樣品中提取DNA的方法，可以是從植物材料中提取DNA 的各種常用方法，例如可以是CTAB法、SDS法或經驗證適用于植物DNA提取的試劑盒等各 種方法。
[0015] 所述PCR擴增體系按照以下方式建立：反應體系的總體積為25. OyL，其中， 10XLA Taq Buffer II(Mg 2+Plus)緩沖液 2.5yL，5U/yL 的 TaKaRa LA Taq 聚合酶 0.25yL，dNTP Mixture(2.5mM each)4.0yL，10ymol/L SEQ ID No.l 所示的引物 lyL， 10 4!11〇1/13￡0 10吣.2所示的引物11^，25即/1^0嫩模板2 1^，余量為雙蒸水。
[0016] 所述PCR擴增的條件為：94°C變性 lmin ;98°(：，1〇8,66°(：，5111111，30個循環；72°(：延 伸 10min〇
[0017] -種轉基因水稻PA110-15外源基因純合雜合狀態的PCR檢測試劑盒，包括： 10XLA Taq Buffer II 緩沖液，TaKaRa LA Taq 聚合酶，dNTP Mixture，引物和雙蒸水；所 述引物的核苷酸序列為序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的序列。
[0018] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：本發明檢測方法能夠準確的檢測出 轉基因水稻PA110-15外源基因插入的純合/雜合狀態，為轉基因水稻PA110-15成分檢測 標準物質研制、轉基因定量檢測、樣品鑒定奠定了基礎。
【附圖說明】
[0019] 圖1是PCR方法鑒定轉基因水稻PA110-15純合體瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0020] 圖中，M :1Kb plus DNA Marker ;1 :空白對照；2 :PA110-15 受體；3 :PA110-15 純合 體；4 :PA110-15受體和PA110-15純合體混合樣品。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合附圖，對本發明的【具體實施方式】進行詳細描述，但應當理解本發明的保 護范圍并不受【具體實施方式】的限制。
[0022] 實施例1轉基因水稻PA110-15外源基因純合/雜合狀態的PCR檢測方法的建立
[0023] 1、引物設計及序列
[0024] 該轉化體外源整合結構位于水稻基因組4號染色體上，其中，引物PA110-LA-F位 于5'端水稻基因組上；引物PA110-LA-R位于3'端水稻基因組上。
[0025] 引物序列
[0026] PA110-LA-F ：TCGATCAGTGCATCTGCTGTGGCT(SEQ ID No. 1)〇
[0027] PA110-LA-R ：TCATACATAGGAATGCGAAGCCGAAGAT(SEQ ID No. 2)〇
[0028] 2、PCR擴增反應體系及反應程序：
[0029] 反應體系：10XLA Taq Buffer II(Mg 2+Plus)緩沖液2. 5yL，TaKaRa LA Taq(5U/ y L)聚合酶 0? 25 y L，dNTP Mixture (2. 5mM each) 4. 0 y L，10 y mol/L SEQ ID No. 1 所示的 引物11^，10 4111〇1/13￡0 10吣.2所示的引物11^，25即/1^0嫩模板2 1^，用去離子水 補至25yL。
[0030] 由于擴增大的基因片段出現假陰性的概率較大，常常將雜合轉基因水稻誤認 為是非轉基因水稻，因此，有必要優化一下反應體系，使得出現假陰性的概率降低，通 過反復實驗，摸索出來一套假