一種棘腹蛙感染腐敗希瓦氏菌的pcr檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于一種生物工程技術和生物醫學領域，具體涉及一種檢測棘腹蛙感染腐 敗希瓦氏菌的檢測試劑盒及檢測方法，適用于棘腹蛙的感染腐敗希瓦氏菌的檢測。
【背景技術】
[0002] 棘腹蛙是一種營養豐富且具藥用價值的大型山區食用蛙，其鮮肉干樣中蛋白質含 量為16. 25%、脂肪含量為1.26%，具有豐富的滋補功效和藥用價值，隨著人民生活水平的 不斷提高，棘腹蛙的食用價值也在逐漸上升，具有較好的開發前景。同時作為脊椎動物進化 中的過渡動物，是進行解剖學、遺傳學和胚胎發育學研究較為理想的實驗動物。由于環境 污染嚴重、野生棲息地遭受破壞、人類大肆捕殺等因素造成棘腹蛙野生種群數量大量減少； 為保護其野生資源，同時滿足市場需求，棘腹蛙的人工養殖逐漸受到重視。但是，隨著養殖 數量的不斷增多，隨之而來的多種病害對棘腹蛙養殖產業的發展產生嚴重威脅。感染蛙類 的病原菌主要有溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、鏈球菌等，可見棘腹蛙細菌性疾病是人工養 殖過程中常見且危害極大的一類疾病，對細菌性疾病的研究也是棘腹蛙人工養殖的一個重 點。目前還沒有檢測棘腹蛙感染腐敗希瓦氏菌的報道。
[0003] 腐敗希瓦氏菌在分類上屬于不動桿菌屬，是一種條件致病菌，一般在養殖環境惡 化、養殖種類體質下降等情況下才導致疾病發生；該菌株可導致水生動物腸道腐敗、體表潰 瘍、體內組織發生敗血性病變。近年來，國內外有大量關于水生動物腐敗希瓦菌的報道，在 鯉魚、虹鱒、大黃魚和大菱鲆上都有分離出并確定為優勢菌株。由此可見，腐敗希瓦氏菌給 水產養殖產業帶來了巨大傷害。為了及早發現棘腹蛙是否被腐敗希瓦氏菌感染，有必要建 立一種快速、準確、靈敏的檢測方法。
[0004] CN102382888公開一種腐敗希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR檢測方法，其特征在于 包括下述步驟：1)、抗體制備：將濃度為109cfu/mL的腐敗希瓦氏菌液0. 20mL注射于小鼠 腹腔內首次免疫，間隔一周相同劑量的腐敗希瓦氏菌液加強免疫一次，共加強免疫三次，每 次加強免疫的腐敗希瓦氏菌液濃度為l〇l〇 Cfu/mL，最后一次加強免疫后第四天，摘除小鼠 眼球取血，血液置于37°C下溫育0. 5h，4°C下3000r/min離心15min，取上清，得到腐敗希 瓦氏菌抗體溶液；2)、免疫磁珠制備：取48mg的Fe304磁珠先后用乙醇和雙蒸水超聲清洗 干凈，用雙蒸水定容至20mL得磁珠溶液，在10mL磁珠溶液中，加入質量濃度為10%戊二 醛溶液2mL，室溫下攪拌3h，固液分離后用磷酸吐溫緩沖液清洗磁珠，所述磷酸吐溫緩沖液 中由磷酸緩沖液與吐溫20配制而成，所述磷酸吐溫緩沖液中所述吐溫20的體積百分濃 度為0. 03~0. 07 %，再將清洗后的磁珠懸浮于2mL磷酸緩沖液中，所述磷酸緩沖液的pH 為7~7. 5,然后加入50 y L上述腐敗希瓦氏菌抗體溶液，4°C下輕輕攪拌12h，得到腐敗希 瓦氏菌免疫磁珠溶液，4°C保存備用；3)、待測樣品富集：在盛有0. lmL的上述腐敗希瓦氏 菌免疫磁珠溶液中加入lmL待測樣品液，室溫下輕緩旋轉振蕩30min，將試管置于磁性細 胞分離架上3min，移出管中液體，每次用1. OmL上述磷酸緩沖液清洗腐敗希瓦氏菌免疫磁 珠，重復清洗3-5次，清洗完畢，加入0. 5~lmL無菌水，磁性分離，取出腐敗希瓦氏菌免疫 磁珠后，得到富集的待檢樣品溶液；4)、模板DNA制備：將上述待檢樣品溶液，在100°C溫度 下煮沸l〇min，12000r/min離心5min，取上清，得到模板DNA溶液；5)、PCR反應：取上述模 板DNA溶液5 y L，加入到由含有熒光染料的TaqTMII混合液10 y L、引物濃度為10 y M的 FQF引物溶液0. 5 y L、引物濃度為10 y M的FQR引物溶液0. 5 y L的反應體系中，用無菌水 定容至20yL，反應程序：95°C預變性5min ;94°C變性5s、50°C退火15s、72°C延伸15s，共 45個循環；PCR反應中若有熒光信號響應，待檢樣品溶液含有腐敗希瓦氏菌；所述FQF引物 溶液含有序列為GTGAAACTCATTTGGGTTGTAT的特有性引物，所述FQR引物溶液含有序列為 CCGTTCGGAAATCGTTAG的特有性引物；6)、上述步驟1-5的方法為非診斷疾病的方法
[0005] CN103820544A公開一種檢測水產品中腐敗希瓦氏菌檢測方法，包括如下步驟：a、 腐敗希瓦氏菌的分離：無菌取鮮活水產樣品l〇g，加入無菌蛋白胨生理鹽水制成溶液，稀釋 后涂布于大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA)上進行培養，挑取菌落，分別劃線到鐵瓊脂平板上繼 續培養，挑取黑色的菌落，收集細菌，抽提DNA ;b、PCR分離鑒定：提取待測的產硫化氫細菌 的基因組DNA，進行PCR擴增。擴增的引物對選自以下引物：第一引物對為一條引物的序列 為 F-CAGITGGGCCTITGATGCTT，記為 SEQIDN0. 1，另一條的序列為 R-CACAGAGGTCCCTTCATCGA， 記為SEQIDN0. 2 ;或者是第二引物對為一條引物的序列為F-TCAGGATAAAACATTACCATTGGA， 記為 SEQIDN0. 3,另一條的序列為 R-CCAGGAAAATCTTGGTGGAA，記為 SEQIDN0. 4。
[0006] 以上檢測方法繁瑣，特別是針對棘腹蛙，其檢測棘腹蛙否被腐敗希瓦氏菌感染缺 乏特異性和敏感性，針對棘腹蛙，有必要研究一種操作簡單、快速、特異性和敏感性好的檢 測試劑盒，用于檢測。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是，克服現有技術的不足，提供一種檢測棘腹蛙感染 腐敗希瓦氏菌的PCR檢測試劑盒，該試劑盒用于檢測棘腹蛙是否被腐敗希瓦氏菌感染具有 良好的特異性和敏感性。能快速、高效地用于腐敗希瓦氏菌的檢測。
[0008] 本發明的一種檢測棘腹蛙感染腐敗希瓦氏菌的PCR檢測試劑盒，包括2倍反應 混合緩沖液、Taq酶、上游引物S-F :5' - CCCCTATCCTTAITTGCC - 3'和下游引物S-R :5' -CTAGCGATTCCGACTTCAT - 3'。
[0009] 上述本發明的PCR檢測試劑盒，還包含陽性對照液和陰性對照液，其中，所述陽性 對照液為感染腐敗希瓦氏菌的棘腹蛙的基因組DNA ;所述陰性對照液為ddH20。
[0010] 上述本發明的PCR檢測試劑盒，還包含滅菌的ddH20。
[0011] 上述本發明的PCR檢測試劑盒，所述2倍反應混合緩沖液1. OmL，包含以下成分：
[0012] KC1 20mM, MgCh Tris-HCl, pH5.8 40mM， 碰TP. 2.,5mM。
[0013] 上述本發明的PCR檢測試劑盒，所述上游引物S-F和下游引物S-R的濃度各為 10 y M/L，所述 Taq 酶為 5U/ y LTaq 酶。
[0014] 在一具體實施方案中，本發明的一種檢測棘腹蛙感染腐敗希瓦氏菌的PCR檢測試 劑盒，包括2倍反應混合緩沖液、Taq酶、滅菌的ddH 20、陽性對照液、陰性對照液、上游引物 S-F : 5，_ CCCCTATCCTTATTTGCC _ 3，和下游引物 S-R : 5，_ CTAGCGATTCCGACTTCAT _ 3 '，其 中，
[0015] 所述2倍反應混合緩沖液1. OmL，包含以下成分：
[0016] KC! 20mM, MgCh 25mM, Tris~HCK pH5.8 40mM. dN丁P 2.5mMc
[0017] 在上述具體實施方案中，本發明的PCR檢測試劑盒，所述陽性對照液為感染腐敗 希瓦氏菌的棘腹蛙的基因組DNA ;所述陰性對照液為ddH20。
[0018] 在上述具體實施方案中，本發明的PCR檢測試劑盒，所述上游引物S-F和下游引物 S-R的濃度各為10 y M/L，所述Taq酶為5U/ y L Taq酶。
[0019] 本發明還提供了一種采用本發明的PCR檢測試劑盒檢測棘腹蛙感染腐敗希瓦氏 菌的方法，包括以下步驟：
[0020] (1)棘腹蛙DNA的提取：
[0021] ①取病蛙眼、口腔或胃，剪碎后置于勻漿器中，加入勻漿液后冰浴研磨，研磨碎裂 后置離心管中；
[0022] ②加入1 % -3%的0 -巰基乙醇溶液，混勻后60-70°C水浴0. 5-lh，每隔3-5分鐘 取出搖勻一次；
[0023] ③10000-15000rpm離心3_7min，離心后，移出上清液液于另一無菌離心管中，棄 沉淀；
[0024] ④向上清液中加入等體積的按體積比20-30 :1的氯仿：異戊醇的混合溶劑，混勻 后，8000_12000rpm離心5_15min，取上清液至另一無菌離心管中；
[0025] ⑤加入等體積的氯仿，混勾后8000-12000rpm離心5-15min，再取上清液；
[0026] ⑥向上清液中加入0. 8-1. 2倍體積的2-4M NaAc溶液，混勻后再加入1. 5-2. 5倍 體積預冷的無水乙醇，充分混勻后-18°C以下放置30min以上；
[0027] ⑦10000-15000rpm離心3_7min，棄上清液，所得DNA沉淀在室溫下瞭干；
[0028] ⑧用70-80 %的乙醇對DNA沉淀進行洗滌，干燥后沉淀溶于TE中，加RNase A，37°C 消化20-40min，得到棘腹蛙DNA后于-20°C保存。
[0029] (2)PCR反應體系：采用20yL的PCR反應體系，在0. 2mL PCR反應管內分別加入2 倍反應混合緩沖液10 y L，上游引物、下游引物各0.