對水產養殖環境沉積物中反硝化微生物的定量方法
【技術領域】：
[0001] 本發明涉及一種對水產養殖環境沉積物中的反硝化微生物進行實時熒光定量PCR 檢測的方法，屬于環境微生物生態學技術領域，該技術用于測定水產養殖沉積物中反硝化 微生物的數量。 技術背景：
[0002] 我國是世界第一的水產養殖大國和水產品貿易大國，2012年水產品總量就達到了 5907. 68萬噸，約占全球總量的38%，連續24年位居世界首位。為了提高單位產量，養殖 過程中往往過量投入肥料、餌料等，導致養殖環境中殘餌、動物排泄物及尸體不斷堆積，碳、 氮、磷的含量超標，富營養化程度嚴重，養殖生物頻繁發生病害或死亡。這不但降低了養殖 業的產量和質量，還污染了養殖環境，并隨著養殖環境廢水的排放影響到周邊環境。對養殖 生物和環境的危害最大的物質是含氮化合物，如氨氮、亞硝酸根、硝酸根等，有效去除含氮 污染物是保證水產養殖業可持續發展的前提。
[0003] 在氮素循環中，消除氮污染、降低富營養化主要依賴反硝化過程。反硝化過程大 致可分為四步：N0 3 - N0 2 - N0 - NO 2- N 2，這四步都由反硝化微生物進行。反硝化微生 物是一類能夠把硝態氮（N03-N)轉化為氣態氮（N 2)的微生物群落，地理分布比較廣泛，在 土壤、海洋、河口、湖泊等自然環境和廢水處理廠、堆肥、生物反應器等人工環境中都有發 現。在系統發育上，具有很高的多樣性，分屬于假單胞菌屬（P seudomonaceae)、芽孢桿菌屬 (Bacillu s)、產堿桿菌屬（Alcaligene s)等多個屬；在營養方式上，分為異養型和自養型， 大部分屬于異養型，有一些只利用一種碳源，還有一些能夠利用氫氣（H2)、二氧化碳（C0 2) 或其他物質進行自養生長；在需氧情況上，分為好氧型和厭氧型，之前一直認為反硝化微生 物參與反硝化作用需要在厭氧的條件下，隨著研究的進一步開展，好氧反硝化微生物也不 斷被發現。現階段對反硝化微生物的數量測定技術水平有限，傳統的富集培養方法僅能得 到環境中小于1 %的微生物，無法用于對反硝化微生物的研究和定量。分子生態學上常用的 16S rRNA基因，由于反硝化微生物系統發育廣泛的多樣性，也無法設計特異性引物，用來研 究和檢測其群落組成、分布和數量。
[0004] 在反硝化過程的四個步驟中，由亞硝酸鹽（N02)轉化為一氧化氮（N0)的過程，是 反硝化作用有別于其它硝酸鹽代謝的標志性反應，是反硝化過程中最重要的限速步驟，亞 硝酸鹽還原型反硝化微生物也被作為代表性種類，被廣泛用于反硝化微生物種群組成和數 量的研究。亞硝酸鹽還原酶（Nir)是催化此反應的限速酶，可作為分子標記對反硝化微生 物進行定量研究。亞硝酸鹽還原酶存在于細胞周質中，有兩種類型，一種是可溶性含銅酶 (Cu-Nir)，含有Cu催化中心，稱為Cu型亞硝酸鹽還原酶，由nirK基因編碼；另一種是細胞 色素還原酶（cdl-Nir)，含有細胞色素c和dl，稱為Cyt cdl型亞硝酸鹽還原酶，由nirS基 因編碼。兩種酶功能相同，但結構和催化位點不同，而且不能共存于同種細胞中。在同一環 境中，含有兩種Nir酶的微生物同時存在。
[0005] 現有的研究和報道多集中于對nirS基因的研究，也有少量對nirK基因的報道。 在李敬源等[1]對典型對蝦水體中參與硝化與反硝化過程的微生物群落結構的研究中，使 用PCR-DGGE的方法，對蝦塘的8個站位構建nirS基因文庫，并通過RFLP對克隆文庫進行 酶切分析；研究結果顯示，典型蝦塘養殖水體中nirS基因文庫群落結構比較復雜，多樣性 豐富。在宋亞娜等 [2]對稻田土壤nirS型反硝化細菌群落對氮肥水平響應的研究中，使用 PCR-DGGE結合DNA克隆測序和熒光定量PCR技術對反硝化細菌nirS基因進行檢測，分析 田間定位試驗第4年不同氮肥水平下，稻田nirS型反硝化細菌群落結構和豐度的變化；結 果表明，稻田表層土壤的nirS型反硝化細菌群落對氮肥水平提高的響應程度更為明顯。在 程占冰等 [3]對淡水富營養型湖泊沉積物nirS基因的多樣性和系統發育的研究中，構建了 nirS基因文庫，并使用RFLP技術對基因文庫進行分析，測定序列并構建系統發育樹；結果 顯示，武漢東湖淡水富營養型湖泊沉積物中nirS基因多樣性較為豐富，且TN、NH 4+和N03的 濃度可能是影響nirS類反硝化微生物多樣性和空間分布的重要因素之一。在曾希柏等 [4] 對設施菜地nirK型反硝化細菌群落結構和豐度受施肥影響的研究中，使用T-RFLP和實時 熒光定量PCR的方法，對不同施肥條件不同土層下nirK型反硝化細菌群落結構和豐度的變 化進行研究；結果表明，施肥對土壤中nirK型反硝化細菌的群落結構具有明顯的影響，土 壤pH值、有機質及硝酸鹽含量均影響nirK型反硝化細菌的群落結構和豐度。但是，單獨對 某一種類型Nir基因的檢測必然會損失另一種類型微生物的信息，不能全面反映反硝化微 生物的種群組成和數量。只有同時檢測nirK和nirS基因的數量，才能得到反硝化微生物 全面而準確的數量信息。
[0006] 本發明使用實時熒光定量PCR(qPCR)的方法檢測養殖環境中的反硝化微生物。 qPCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，通過檢測整個過程中熒光信號的累積來實時 監測PCR過程。qPCR技術具有操作簡單、自動化程度高、全封閉不易污染、特異性強、重復 性好、靈敏度高、通用性好等優點。使用實時熒光定量PCR的方法對反硝化微生物功能基因 nirK和nirS進行定量研究，能夠快速、靈敏、準確的對水產養殖環境中兩種不同類型反硝 化微生物的數量進行檢測，全面分析養殖環境中反硝化微生物的數量，對解決水產養殖環 境氮素污染及富營養化問題具有重大意義。
[0007] 參考文獻
[0008] [1]李敬源，林煒鐵，羅劍飛，田國梁.典型對蝦養殖水體中參與硝化與反硝化過 程的微生物群落結構.微生物學報，2012, 52(4) :478-488.
[0009] [2]宋亞娜，吳明基，林艷.稻田土壤nirS型反硝化細菌群落對氮肥水平的響 應?中國農業科學，2013,46(9) :1818-1826.
[0010] [3]程占冰，楊江科，李鶴，朱兵，陳相軍，閆云君.淡水富營養型湖泊沉積物亞硝 酸還原酶基因（nirS)的多樣性和系統發育.微生物學報，2011，51 (5) :667-675.
[0011] [4]曾希柏，王亞男，王玉忠，白玲玉，李蓮芳，段然，蘇世鳴，吳翠霞.施肥對設施 菜地nirK型反硝化細菌群落結構和豐度的影響.應用生態學報2014, 25(2) :505-514.
【發明內容】
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[0012] 本發明的目的在于提供一種實時熒光定量PCR檢測反硝化微生物的方法。使用實 時熒光定量PCR技術，對反硝化微生物編碼亞硝酸鹽還原酶的功能基因nirK和nirS進行 定量研究，從而實現對水產養殖環境中反硝化微生物快速、靈敏、準確的定量研究。實現本 發明的過程主要包括以下步驟：
[0013] 1、宏基因組DNA的提取
[0014] 沉積物樣品宏基因組DNA使用土壤DNA快速提取試劑盒，在核酸提取儀上提取，操 作方法如下：稱取0. 3g樣品，加入到裂解反應管中，向管中加入1100 y 1裂解緩沖液。裂解 反應管放入核酸提取儀中，設定速度4. 5,時間30s，進行裂解。結束后在4°C，13000rpm離心 15min，上清移入新的離心管，加250 y 1蛋白沉淀緩沖液，混勾；4°C，13000rpm離心5min，上 清移入新的離心管中，加入1000 y 1已經搖勻的懸浮液，顛倒混勻2min，放于管架上4°C靜 置3min。吸出600 y 1上清丟棄，混勻后液移入純化柱中，4°C，llOOOrpm離心lmin，倒掉廢 液。向純化柱中加500 y 1加入無水乙醇的洗滌緩沖液，4°C，llOOOrpm離心lmin，倒掉廢液， 重復三次，4°C，llOOOrpm離心2min。將純化柱放入新的1. 5ml離心管中，室溫干燥5min。 純化柱加入溶解緩沖液，55°C水浴6min，4°C，llOOOrpm離心lmin，即得到待測樣品的宏基 因組DNA。使用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，存于-80°C備用。
[0015] 2、特異性引物的確定
[0016] 目前，針對nirK和nirS基因設計的特異性引物有很多，如nirK基因特異性引 物：FlaCu/R3Cu、FlaCu/nirK3R、FlaCu/nirK5R、nirKlF/R3Cu、nirKlF/nirK3R、nirKlF/ nirK5R 等；nirS 基因特異性引物：cd3aF/R3cd、cd3aF/R4cd、cd3aF/nirS4R、cd3aF/nirS6R、 nirSlF/R3cd、nirSlF/nirS6R、nirSlF/nirS4R、nirS3F/nirS6R 等，這些引物分別匹配基因 的不同保守位點，并且擴增出來的基因片段大小不同。在選擇引物時，考慮到所研究的水產 養殖環境中硝酸根、亞硝酸根等含量偏高的特點，并且已報道的反硝化微生物絕大部分屬 于變形細菌、假單胞菌、產堿桿菌、微球菌等菌屬。我們經過試驗后，最終確定了擴增nirK 基因的引物為FlaCu/R3Cu，擴增nirS基因的引物為cd3aF/R3cd。
[0017] 3、標準質粒的構建
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