一種稻屬12個物種的基因組bac同源區篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學技術領域的基因組BAC (細菌人工染色體）同源區篩選方 法，特別涉及一種通過特殊設計的方案進行兩輪southern雜交來篩選基因組BAC同源區的 方法。
【背景技術】
[0002] 對包含二倍體、四倍體等不同基因組類型在內的親緣關系較近的多個植物物種開 展基因組比較研究是了解植物基因與基因組發展、進化的有力手段。多個物種整個基因組 的比較能對所分析物種得出比較全面的認識，但因全基因組信息量的巨大使得對比較重要 的某些基因位點分析欠詳細。農業生產上包含水稻、小麥在內的綠色革命都是由于少數幾 個關鍵基因的利用而引發的，如由于水稻、小麥資源中少數幾個矮桿基因的開發利用而引 發了第一次"綠色革命"；野生稻資源中"野敗"的發現與應用對我國的雜交水稻取得巨大 的成功起著關鍵的作用。但是，小麥-黑麥1BL/1RS易位系的利用歷史表明，雖然1RS上抗 三種銹病基因（及抗白粉病基因（乃訪)使普通小麥的抗病性得到了很好的 遺傳改良，但1RS上所攜帶的不良基因使易位系小麥的加工品質變劣，面團耐揉性減弱、面 團發黏等問題。如何搞清重要性狀基因區基因組成？是否有不利基因連鎖？是否存在重要 性狀基因的保守調控位點？等等，這些問題的解決需要開展近緣物種間重要功能基因所在 同源區的比較研究。
[0003] 基因組BAC文庫是進行基因組BAC同源區研究的必要資源。迄今為止，眾多生物中 已經構建了大量的基因組BAC文庫。分蘗是水稻、小麥等禾本科作物所具有的一個重要農 藝性狀，與創建理想株型密切相關，因而廣受世界各國廣泛關注。BAC文庫篩選可以有PCR 法、southern雜交法等多種方法。粳稻日本晴中分蘗控制基因（#(尤7)已被成功克隆。針對 #(尤7及其所在BAC同源區采用特殊設計的方案進行兩輪southern雜交方法來篩選#(967所 在稻屬12個物種的同源區BAC，目前尚未見有專門報道。本發明所介紹的方法解決了如何 從12個栽培稻的近緣物種的基因組BAC文庫中快速有效的進行同源序列區盡可能長的基 因組BAC篩選問題。
【發明內容】
[0004] 本發明通過特殊設計的方案采用兩輪southern雜交的方法實現了 所在稻屬 12個物種的同源區BAC的篩選。
[0005] 1野生稻基因組BAC文庫的第一輪篩選。
[0006] 本發明所用的BAC文庫涵蓋了稻屬12個物種、10種不同的基因組類型（AA、BB、 CC、EE、FF、GG、BBCC、CCDD、HHJJ、HHKK)(見表 2)。
[0007] 1.1關于"錨定探針"。
[0008] 本發明"錨定探針"即麗尤7,為單外顯子基因（圖1A)，水稻基因組只有單拷貝，位 于水稻6號染色體的長臂上（圖1E)，屬于GRAS轉錄因子基因家族（圖1D)-員。從蛋白結 構上看，該基因家族在N端富于變化而C端很保守。為保證southern雜交的特異性本發明 特在#<967編碼區的5'端即蛋白質多肽鏈的N端設計引物（引物序列見表1)進行探針片段 的擴增（圖1A)。擴增（圖1B)及測序結果（圖1C)表明#067探針制備良好。
[0009] 1.2野生稻基因組BAC文庫第一輪篩選結果。
[0010] 用"錨定探針"#(尤7以Southern雜交的方法對野生稻基因組BAC文庫進行初步篩 選，共篩選到195個陽性BAC克隆(表2)。其中篩選到陽性BAC克隆最多的是HHKK基因組 型的(9. coarc (a te，篩選到22個，最少的是BB基因組型的（9. (a te，只篩選到8個。 這是符合預期結果的，異源四倍體基因組因含有2個#<967位點，故應篩選到較二倍體多約1 倍的陽性BAC克隆。值得注意的是，同是二倍體基因組如CC和BB，篩選到的陽性BAC克隆 數目相差1倍(前者16個，后者8個)，這暗示該2個二倍體基因組在#<967同源區歷iJ/// 的酶切位點存在較大差異，前者（CC組）應該比后者（BB組）存在更多的歷>^///酶切位點。
[0011] 表1用于BAC克隆篩選的探針引物序列。
[0012]
[0013] 表2麗?67探針從野生稻BAC文庫中篩選到的陽性克隆。
[0013]
[0014] 2對第一輪篩選出的陽性BAC的第二輪篩選。
[0015] 第一輪篩選得到的陽性BAC克隆很多，以麗?67在這些BAC中的位置來看，可以將 它們分成3類，8卩#067中間型、#067偏左型、#067偏右型。本發明預從這些BAC中鑒定出 稻屬植物各基因組類型的#<尤7中間型的同源BAC，以利于進行#<967及其上、下游基因在稻 屬植物中進化演變的比較分析。故本發明又設計了 上游2個、下游3個基因的探針(供 參考的日本晴BAC中#(967位于中間偏左)，用來對第一輪篩選的陽性BAC作進一步篩選。第 二輪篩選探針的分布見圖2,引物序列見表1，PCR擴增結果見圖3 (探針776未用）。
[0016] 將第一輪篩選得到的陽性BAC克隆用辦hJ///酶切后轉膜，之后用第二輪篩選探針 進行Southern雜交，結果見圖4~圖6 (為了節省篇幅僅將二倍體、四倍體部分雜交結果圖 列出）。
[0017] 3篩選結果。
[0018] 根據不同探針雜交的模式（pattern)進行綜合判斷，最后選出的BAC克隆及其探 針分布情況見圖7及表3。從圖7可以看出，選出的BAC克隆多數符合預期目標，少數克隆 有些偏向下游。結果表明，在同屬不同物種植物間進行重要基因直向同源區BAC篩選時采 用兩輪southern雜交法篩選是簡單可行的。
[0019] 表3最終選定的野生稻各基因組類型BAC文庫中#(967同源BAC及編號。
[0020]
【附圖說明】
[0021] 圖1關于探針的信息。
[0022] #<967探針的擴增區域(A，灰色方框)、擴增結果（B )、測序結果與模板序列的比對 (C，上部為測序結果，下部為模板序列)、所屬基因家族蛋白質結構特征（D，不同大小及灰色 的長方框表示該蛋白的Motif構成，其上字母或羅馬數字表示該Motif的名稱，圖的左側所 列為該蛋白的名稱，灰色箭頭所示表示#<尤7的N端)和染色體位置（E，箭頭所示表示水稻6 號染色體著絲粒)。
[0023] 圖2第二輪篩選探針在日本晴麗?67 BAC上的相對位置。
[0024] 圖中UP、DP分別表示該探針在#(967的上游、下游；UP、DP前面的數字表示探針與 #(尤7位點間的相對距離（以kb為單位）；UP、DP后面的數字表示該探針的長度。
[0025] 圖3第二輪篩選用探針的擴增結果。
[0026] 圖4二倍體野生稻(9. 汾w BAC克隆的southern雜交第二輪篩選。
[0027] 根據不同探針的、不同雜交模式第19個BAC克隆被選定。
[0028] 圖5二倍體野生稻ft BAC克隆的southern雜交第二輪篩選。
[0029] 根據不同探針的、不同雜交模式第7個BAC克隆被選定。
[0030] 圖6四倍體野生稻(9. azi/wte BAC克隆的Southern雜交第二輪篩選。
[0031] 根據不同探針的、不同雜交模式第8個BAC克隆和第15個BAC克隆被選定；四倍 體因有2個同源位點故根據雜交模式應選取兩個不同的BAC克隆。
[0032] 圖7野生稻各基因組類型中選定BAC的探針分布。
[0033] 圖上部表不探針名稱；圖右側表不該BAC的編號，該編號所代表的克隆見表3。
[0034]
【具體實施方式】
[0035] 1 Southern 探針的制備。
[0036] 1. 1探針類型。
[0037] 分兩種，一是"錨定探針"，用于對野生稻的BAC文庫進行第一輪篩選；二是"限定 探針"，用于對第一輪篩選鑒定出來的陽性克隆進一步篩選。前者所用的是分蘗控制基因 #(967,后者是麗?67上游2個基因（距麗?67約42kb、53kb處各一個）的探針和下游3個基因 (距麗?67約42kb、52kb、62kb處各一個）的探針。
[0038] 1.2 探針 PCR 擴增。
[0039] 以梗稻日本晴（satiKa L. ssp. Ja/jonica cv. Nipponbare)的基因組DNA 為模板進行PCR擴增。引物序列見表1。
[0040] "錨定探針" #(967的擴增因其GC含量較高（>75%)，故使用GC緩沖液（GC buffer I，含5mmol/L Mg2+)，體系為：LA 7a濟每，0? 3yL ;2XGC buffer I，12. 5yL ;dNTP， 3yL;模板DNA 100 ng;引物4yL;加ddH20至25yL。擴增程序為：94°C，變性4min; (94°C，30s ;59°C，30s ;72°C，lmin) 30 次循環；72°C，延伸 5min ;4°C保存。
[0041] "限定探針"的擴增采用常規方式進行。體系為：普通ra濟每，0. 25 y L ;10Xbuffer (含 5mmol/L Mg2+)，2. 5yL ;dNTP，2yL ;模板 DNA 100ng ;引物 2yL ;加ddH20