一套金銀花種質鑒定引物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物品種鑒定領域，涉及一套金銀花種質鑒定引物及其應用。
【背景技術】
[0002] 簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR)或者微衛星序列（Microsatelite， MS)是指基于真核生物基因組DNA中存在簡單重復序列且重復序列的數目變化很大而產生 的，重復序列的側翼為十分保守的單拷貝序列，因此SSR具有很強的多態性。SSR標記相比 于其他分子標記的優勢在于具有共顯性標記（鑒別雜合子、純合子）且重復性好的特點。劣 勢在于其引物設計必須依賴于簡單重復序列。SSR分子標記目前已應用于種質資源親緣關 系、遺傳連鎖圖譜構建和遺傳多樣性等研究。
[0003] 目前，SSR標記已在藥用植物育種、指紋數據庫的構建、品種鑒定及種子純度方面 得到了廣泛的應用。Szewc-McFadden等利用SSR序列篩選甘藍型油菜基因組文庫，獲得的 17對SSR引物皆能在蕓薹（AA)、甘藍（CC)及甘藍型油菜（AACC)材料中擴增出產物，其中 13對SSR引物的擴增產物具有多態性。Marion等利用該技術從含有A、B、D 3個染色體組 的六倍體小麥基因組中開發出230對SSR引物，其中大多數引物都是基因組特異性的，小麥 主要有 AG-SSR、CA-SSR、TA-SSR、TC-SSR、GT-SSR。Kresovieh 等通過構建油菜含 15000 份 克隆的小片段基因組文庫，獲得了豐富的油菜SSR標記，發現其中GA重復單位的數量是CA 和GATA的4-5倍。Uzunova等在篩選白菜基因組文庫SSR序列時，發現每100kb就有1個 GA/TC重復序列，而CA/TG的豐度只是GA/TC的1/4。因此，SSR標記具有豐富的多態性，可 有效的分析栽培金銀花種質資源的遺傳多樣性。
[0004] DNA指紋圖譜（DNA finger print)是以DNA標記為基礎的，能將品種之間彼此區 分開的電泳圖譜，構建的指紋圖譜在不同種質間具有特異性，能夠快速的、準確的鑒別品種 或品系，為良種選育和品種純度鑒定提供便利。目前，SSR標記指紋圖譜的構建在遺傳多樣 性分析、比較基因組研究等方面有廣泛的應用。
【發明內容】
[0005] 本發明的第一個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定金銀花種質的成套引物對 組。
[0006] 本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定金銀花種質的成套引物對組，具體由如下7 個引物對組成：由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對1 ;由序 列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對2 ;由序列表中序列5和序 列6所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對3 ;由序列表中序列7和序列8所示的兩條單 鏈DNA分子組成的引物對4 ;由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA分子組成的 引物對5 ;由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對6 ;由序列 表中序列13和序列14所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對7。
[0007] 其中，所述引物對組中的各引物對分別單獨包裝。組成各引物對的兩條單鏈DNA 分子既可以分別單獨包裝，也可以以摩爾比為1:1的比例混合包裝（4°C以下保存）。
[0008] 本發明的第二個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定金銀花種質的成套PCR試 劑。
[0009] 本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定金銀花種質的成套PCR試劑，具體由如下7 種PCR試劑組成：由所述引物對組中的引物對1、PCR擴增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑1 ;由所述引物對組中的引物對2、PCR擴增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑2 ;由所述引物對組中的引物對3、PCR擴增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑3 ;由所述引物對組中的引物對4、PCR擴增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑4 ;由所述引物對組中的引物對5、PCR擴增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑5 ;由所述引物對組中的引物對6、PCR擴增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑6 ;由所述引物對組中的引物對7、PCR擴增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組 成的PCR試劑7。
[0010] 其中，所述成套PCR試劑中的各PCR試劑分別單獨包裝。各PCR試劑的組分既可以 分別單獨包裝，也可以是組成如下的混合液：每24 y L PCR試劑中含有19. 8 y L水，2. 5 y L 10父？0?擴增緩沖液（含15111111〇1/1]\%(：12)，11^2.5111111〇1/1(1犯1 38，1(^111〇1/1上下游引物 各 0? 25 y L，2. 5U DNA 聚合酶 0? 2 y L。
[0011] 本發明的第三個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定金銀花種質的試劑盒。
[0012] 本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定金銀花種質的試劑盒，含有所述的引物對組 或所述成套試劑。
[0013] 以上所述金銀花種質均可選自如下53個金銀花種質中的任一種：河北紅銀花、河 北九豐一號、河北小雞爪花、河北小線花、河北葉里齊、河北山花子、河北一線紅、河北大麻 花、河北大毛花、河北四季花、河北大站花、河北大線花、河北大雞爪花、河北金豐一號、河北 巨花一號、河南野生1、河南大毛花、河南野生大毛花、河南野生2、河南小毛花、河南線花、 江蘇亞特、江蘇大毛花、江蘇九豐一號、江蘇雞爪花、江蘇-河南引種、江蘇紅、江蘇巨花一 號、江蘇四季花、山東大毛花、山東四季花、山東雞爪花、山東紅金、山東中花一號、山東野生 3、山東亞特紅蕾、山東亞特立本、山東亞特青蕾、山東亞特良種、山東-美國引種、山東-意 大利引種、廣西-山東引種、云南亞特、湖南九豐一號、重慶-山東引種、湖北-河北引種、安 徽-山西引種、陜西金花3號、河南尖山大毛花、河南封丘大毛花、寧夏-山東引種、甘肅亞 特、北京亞特立本。
[0014] 制備所述引物對組的方法和制備所述成套PCR試劑的方法也均屬于本發明的保 護范圍。
[0015] 其中，制備所述引物對組的方法具體可包括將所述引物對組中的所述7個引物對 分別單獨包裝的步驟。制備所述成套PCR試劑的方法具體可包括將所述成套PCR試劑中的 所述7種PCR試劑分別單獨包裝的步驟。
[0016] 所述引物對組或所述成套PCR試劑或所述試劑盒在鑒定或輔助鑒定金銀花種質 中的應用也屬于本發明的保護范圍；所述金銀花種質為以上所述53個金銀花種質中任一 種。
[0017] 本發明的第四個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測金銀花是否屬于所述53個 金銀花種質中的任一種的方法。
[0018] 本發明所提供的鑒定或輔助鑒定待測金銀花是否屬于所述53個金銀花種質中的 任一種的方法，具體可包括：
[0019] (1)以所述53個金銀花種質的基因組DNA為模板，采用所述引物對組或所述成套 PCR試劑或所述試劑盒中的7個引物對分別進行PCR擴增、電泳檢測擴增產物，所述53個金 銀花種質中的每個種質均獲得對應于所述7個引物對的7種含有特異性條帶的電泳圖譜；
[0020] 以待測金銀花的基因組DNA為模板，采用所述引物對組或所述成套PCR試劑或所 述試劑盒中的7個引物對分別進行PCR擴增、電泳檢測擴增產物，得到對應于所述7個引物 對的所述待測金銀花的7種電泳圖譜；
[0021] 同一引物對擴增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜與所述53個金銀花種質的電 泳圖譜相對應；
[0022] (2)將所述7個引物對中每個引物對擴增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜與所 述53個金銀花種質的對應電泳圖譜分別進行比對，根據比對結果按照如下確定所述待測 金銀花是否屬于所述53個金銀花種質：
[0023] 若所述7個引物對中全部引物對擴增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜的條帶 均與所述53個金銀花種質中的某一金銀花種質的對應電泳圖譜中的特異性條帶一致，則 所述待測金銀花屬于或候選屬于該金銀花種質；
[0024] 若所述7個引物對中至少一個引物對擴增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜的 條帶與所述53個金銀花種質中的某一金銀花種質的對應電泳圖譜中的特異性條帶不一 致，則所述待測金銀花不屬于或候選不屬于該金銀花種質。
[0025] 本發明的第五個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測金銀花是否與對照金銀花 屬于同一種質的方法。
[0026] 本發明所提供的鑒定或輔助鑒定待測金銀花是否與對照金銀花屬于同一種質的 方法，具體可包括：
[0027] (1)以對照金銀花的基因組DNA為模板，采用所述引物對組或所述成套PCR試劑或 所述試劑盒中的7個引物對分別進行PCR擴增、電泳檢測擴增產物，得到對應于所述7個引 物對的所述對照金銀花的7種電泳圖譜；
[0028] 以待測金銀花的基因組DNA為模板，采用所述引物對組或所述成套PCR試劑或所 述試劑盒中的7個引物對分別進行PCR擴增、電泳檢測擴增產物，得到對應于所述7個引物 對的所述待測金銀花的7種電泳圖譜；
[0029] 同一引物對擴增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜與所述對照金銀花的電泳圖 譜相對應；
[0030] (2)將所述7個引物對中每個引物對擴增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜與所 述對照金銀花的對應電泳圖譜分別進行比對，根據比對結果按照如下確定所述待測金銀花 與所述對照金銀花是否為同一種質：
[0031] 若所述7個引物對中全部引物對擴增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜的條帶 均與所述對照金銀花的對應電泳圖譜中的特異性條帶一致，則所述待測金銀花與所述對照 金銀花為或候選為同一種質；
[0032] 若所述7個引物對中至少一個引物對擴增得到的所述待測金銀花的電泳圖譜的 條帶與所述對照金銀花的對應電泳圖譜中的特異性條帶不一致，則所述待測金銀花與所述 對照金銀花不為或候選不為同一種質；
[0033] 所述對照金銀花具體可為以上所述53個金銀花種質中任一種。
[0034] 在以上各方法中，采用所述7個引物對擴增得到的所述53個金銀花種質的電泳圖 譜中的特異性條帶如表3所示。
[0035] 在以上各方法中，所述PCR擴增時采用的退火溫度具體可為46-51 °C。所述7個引 物對中每個引物對的PCR擴增時采用的退火溫度具體參見表2。
[0036] 進一步，所述PCR擴增的反應條件具體為：94°C預變性5min ;94°C變性30s，46~ 51°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8,35個循環；72°(：延伸7111111。
[0037] 進一步，所述PCR擴增的反應體系具體為：19. 8 y L ddH20,2. 5 y L 10XPCR擴增緩 沖液，lyL 2.5mmol/L dNTPs，10ymol/L 上下游引物各 0.25yL，2.5U rTaq酶（寶生物工 程（大連）有限公司）〇? 2 y L，1 y L DNA模板。
[0038] 在前述四種方法中，所述電泳具體可為聚丙烯酰胺凝膠電泳；所述聚丙烯酰胺凝 膠電泳中，所述聚丙烯酰胺凝膠的濃度可為8% (質量百分含量）。在本發明中，所述聚丙 烯酰胺凝膠電泳具體為非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。
[0039] 實驗證明，本發明篩選出7對核心SSR引物，這些引物的組合，可以準確的將53個 金銀花種質區分開來，由這些引物組成的指紋圖譜，能更加真實地反映試驗品種的真實遺 傳身份，避免因盲目引種導致的種質混亂。
【附圖說明】
[0040] 圖1為引物SSR9118060和SSR9412929的部分供試金銀花種質的擴增帶型。其中， A為引物SSR9118060的擴增結果；B為引物SSR9412929的擴增結果。圖中，M為Marker(DL 500DNA Marker)，2~46為種質編號（與表1中的編號相對應）。
【具體實施方式】
[0041] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0042] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0043] 下述實施例中涉及的53個金銀花種質（表1)記載于"張山山，袁媛，黃璐琦 等.栽培金銀花非腺毛性狀特征研究.中國中藥雜志，2015年第40卷第3期"和"張山 山，黃璐琦，袁媛等.栽培金銀花農藝性狀的數量分類學研究.中國中藥雜志，2014年第 39卷第8期"中。公眾可以從申請人處獲得用于重復本發明相關實驗。
[0044] 金銀花種質材料"河南牛店大毛花"記載于"張山山，袁媛，黃璐琦等.栽培金銀 花非腺毛性狀特征研究.中國中藥雜志，2015年第40卷第3期"中。公眾可以從申請人處 獲得用于重復本發明相關實驗。
[0045] 表1金銀花53份種質材料
[0046]
[0047]
[0048]
[0049] 實施例1、用于鑒定金銀花種質的SSR引物的篩選
[0050] 本發明對金銀花品種大毛花和雞爪花的花蕾材料進行了基因組測序，去除冗余并 經過拼接，分別獲得4792546和3177510條contig序列，拼接長度分別為417594598bp和 248899172bp。利用生物信息學方法篩選SSR標記。通過ssr. pi程序（http://www. gramene. org/db/markers/ssrtool)搜索已獲得的大毛花和雞爪花基因組序列，識別標準為：二、 三、四、五、六核苷酸重復基序的重復次數分別為10、9、8、7、6、5、4、3次。然后通過131 &^~篩 選大毛花和雞爪花的基因組序列，共獲得13083對同源序列對，其中具有差異的SSR為1697 對，從中篩選出分布平均的22對引物用于PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳，SSR引物信息 見表2。
[0051] 表2 22對SSR引物信息
[0052]
[0053]
[0054]
[0055] 注：表2中的擴增產物是指引物設計時上下游引物所擴增的序列片段，來源于固 定的一條具有合適SSR的contig序列，是所有忍冬都能擴增出來的那段序列，也是最主要 的擴增數量最多的序列，而不同的金銀花種質在這段序列上存在重復基序或者重復次數的 變異，因而可以擴增出不同片段長度的條帶，這也是SSR多態性的主要來源。
[0056] 用所選取的22對SSR引物（表2)在53個金銀花栽培種質（表1)上進行PCR擴 增，均可得到有效的PCR產物，從中篩選出多態性較強、擴增帶型穩定、重復性較好的7對核 心 SSR 引物（SSR9008219, SSR9118060, SSR9122370, SSR9308616, SSR9412929, SSR9553121， SSR9562432)，占所用引物的31. 8%，共檢測到68個等位基因擴增出來的片段，片段大小為 100~700bp之間。
[0057] 實施例2、用于鑒定金銀花種質的SSR引物的應用
[0058] 供試金銀花種質材料為表1中所示的58份種質材料。
[0059] 一、總 DNA 提取
[0060] 用改良CTAB法提取總DNA，具體操作步驟如下：將2XCTAB提取液放在65°C水浴 鍋里預熱，取適量的供試金銀花樣品（干燥的花蕾或葉片）（約0. lg)，裝入2mL離心管中， 每個管都加入一顆經無水乙醇點燃灼熱滅菌的鋼珠，用混合型球磨機打磨1分鐘；將鋼珠 倒出，每管加入900 y L預熱的2 X CTAB提取液，用振蕩器將樣品搖勻，加入10 y L巰基乙醇 (通風櫥內加入）和少量PVP，混勾，置于65°C水浴鍋中溫浴1. 5小時，每隔20min翻勻兩 次；停止水浴，取出材料，室溫下冷卻，加入900 y L氯仿-異戊醇（體積比24:1)溶液，溫和 搖勾5~lOmin，使之成乳池液，用離心機離心10min(12000轉/分鐘）；將上清液750 yL 左右轉移到新的2mL離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比24:1)溶液，用力搖勻 5min，使之充分混勻，離心10min(12000轉/分鐘）；將上清液500 y L左右轉移到新的1. 5mL 離心管中，加入330 y L異丙醇（約占上清液的2/3)，混勻，-20°C冰箱里靜置30min ;4°C冷 凍離心機中離心10min(12000轉/分鐘），棄上清，用500 yL 70%乙醇洗兩次，每次離心 5min (12000轉/分鐘），再用無水乙醇洗兩次，每次離心5min (12000轉/分鐘），最后用吸 水紙吸干，放在37°C烘箱中烘20~30分鐘，使乙醇揮發徹底，加入適量滅菌蒸餾水（50~ 100 y L)，使之溶解，測量0D值并經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，放置于-20°C或4°C冰箱中保 存備用。
[0061] 二、采用SSR引物進行PCR擴增
[0062] 以步驟一得到的各個供試樣本的基因組DNA為模板，分別用表2中的7對核心 SSR 引物對（SSR9008219, SSR9118060, SSR912