一種靶分子濃度的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物檢測方法，特別是涉及一種靶分子濃度的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 高靈敏的生物檢測在疾病的診斷和治療（尤其是疾病發展的早期）、細菌病毒檢 測以及臨床基礎研究中具有重要意義。目前，基于熒光標記的探測方法是實現較高靈敏檢 測的主要手段。在典型的商業化的標記探測技術如生物芯片（chip array)、液相生物芯片 (suspension array)、酶聯免疫放大（ELISA)中，革E1分子首先被固定在探針分子功能化的基 質表面，其后，具有強光學信號的熒光類分子或酶等對固定上的靶分子進行標記，測得的光 學信號強度與樣品中靶分子的濃度具有正相關性，從而實現其濃度測定。在這種標記檢測 方法中，其中所用的熒光類標志物光學亮度普遍偏低，光穩定性差使其極易產生光致漂白 和淬滅，其探測極限一般都不低于10 13mol/L，雖然這些標記檢測方法對于許多疾病檢測診 斷等具有一定的價值，但還遠遠不足以滿足一些高死亡率疾病的早期檢測需求。近年來，基 于單分子探測的高靈敏探測技術得到了人們極大的關注，并有望在檢測靈敏度上，大大超 越傳統的基于熒光強度信號的檢測模式。普通的單分子探測技術往往需要昂貴的儀器支 持，如配置有單光子探測能力的共聚焦熒光顯微鏡、全內反熒光顯微鏡等，在成本上往往過 于昂貴，很難應用于實際的高靈敏檢測中。
【發明內容】
[0003] 為了彌補上述現有技術的不足，本發明提出一種靶分子濃度的檢測方法。
[0004] 本發明的技術問題通過以下的技術方案予以解決：
[0005] -種靶分子濃度的檢測方法，包括如下步驟：
[0006] (1)將第一探針分子偶聯到磁珠表面形成磁珠探針，將第二探針分子偶聯到標記 粒子表面形成標記探針；
[0007] (2)在反應容器中，將所述磁珠探針和靶分子的溶液混合，所述靶分子與所述第一 探針分子反應，所述靶分子被捕獲至所述磁珠探針的表面形成靶分子-磁珠探針復合物；
[0008] (3)將所述標記探針加入所述反應容器，所述靶分子與所述第二探針分子結合，形 成磁珠探針-靶分子-標記探針復合物；
[0009] 或者分別將所述步驟（2)和（3)替換為如下步驟（2'）和（3'），
[0010] (2'）在反應容器中，將所述標記探針和靶分子的溶液混合，所述靶分子與所述第 二探針分子反應，所述靶分子被捕獲至所述標記探針的表面；
[0011] (3'）將所述磁珠探針加入所述反應容器，所述靶分子與所述第一探針分子結合， 形成磁珠探針-靶分子-標記探針復合物；
[0012] (4)將未參與反應的所述標記探針除去；
[0013] (5)在經過步驟（4)后的反應容器中加入洗脫液，使得所述磁珠探針-靶分子-標 記探針復合物發生結構解離，解離成所述磁珠探針、所述靶分子和所述標記探針；
[0014] (6)吸取經過步驟（5)后的溶液在載玻片上制成樣本，在顯微鏡下對所述標記探 針進行計數并計算所述溶液中總的標記探針的數量，通過所述總的標記探針的數量計算所 述革分子的濃度。
[0015] 優選地，所述步驟（2)或者所述步驟（3'）中的所述磁珠探針的加入個數為105-10 7 個。
[0016] 優選地，所述步驟（3)或者所述步驟（2'）中的所述標記探針的加入個數為 1010-10 12 個。
[0017] 優選地，所述步驟（5)中，所述洗脫液的加入量為10-100 iiL。
[0018] 優選地，當所述檢測方法按所述步驟（2)和步驟與（3)的順序進行時，在所述步驟 (2)的反應結束后，還包括如下步驟，然后再進行所述步驟（3):
[0019] (A)在所述反應容器外側引入磁鐵，使所述靶分子-磁珠探針復合物在所述磁鐵 一側聚集，吸取所述反應容器中的液體而不帶走所述靶分子-磁珠探針復合物。
[0020] 經過步驟（A)之后可以減小反應體系的總體積，然后再進行步驟（3)，能進一步提 升后續反應的效率。
[0021] 優選地，所述步驟（4)具體為：在經過步驟（3)或者（3'）反應后的反應容器中加 入PBS緩沖液，然后，在所述反應容器外引入磁鐵，使所述磁珠探針-靶分子-標記探針復 合物在所述磁鐵一側聚集，吸取所述反應容器中的液體將所述未反應的標記探針除去，重 復操作直到所述未反應的標記探針完全除去。
[0022] 優選地，在所述步驟（6)的吸取之前，還包括如下步驟：在經過步驟（5)后的反應 容器外引入磁鐵，將所述磁珠探針在所述磁鐵一側聚集。
[0023] 經過以上技術方案，先將磁珠探針聚集后，溶液中磁珠探針的量減少后，再吸取溶 液，再進行顯微鏡下計數，會更容易對標記探針進行計數，可以提高工作效率。
[0024] 優選地，所述標記粒子為貴金屬納米粒子、焚光微球或者上轉換納米晶。
[0025] 貴金屬納米粒子（如金納米球、金納米棒、金/銀復合納米粒子等），其吸收截面和 散射截面比普通的有機熒光分子高出3-5個量級，具有極高的信噪比，使其可用于諸多標 記相關的高靈敏檢測，尤為重要的是，貴金屬納米粒子甚至可以在普通的暗場顯微鏡下輕 易實現單個顆粒的辨識；類似的可計數的單粒子標志物還有熒光微球（其是將量子點、熒 光染料包覆進入基質微球形成的）和上轉換納米晶，其也能輕易的在熒光顯微鏡下實現單 個識別，這類可單個計數的粒子由于極高的信噪比，其探測成本相對于普通的單分子探測 器件要低得多。
[0026] 優選地，所述靶分子為DNA分子或者蛋白質。
[0027] 優選地，所述貴金屬納米粒子為金納米球、金納米棒或金/銀復合納米粒子。
[0028] 本發明的有益效果還有：本發明中的標記粒子與革E1分子具有 對應關系，且標 記粒子可以在顯微鏡下單個計數，對標記粒子的計數即可實現靶分子的濃度測定，單個靶 分子也能產生可以識別的信號，相比于基于強度的探測方法中需要多個標志物（對應于靶 分子）才能產生可識別的信號具有明顯的靈敏度優勢，此外，本發明的液相的反應環境大 大優化了靶分子的捕獲動力學過程，從而能使得更多的靶分子被捕獲到磁珠探針，有利于 靈敏度的進一步提升。本發明是一種超靈敏的生物檢測方法，在本發明的一個實施例中， 以金納米棒為標記探針對艾滋病毒的某種基因序列進行檢測，其檢測濃度下限可以低至 1. 3X10 18mol/L〇【附圖說明】
[0029] 圖1是本發明的優選實施例的反應原理流程示意圖。
[0030] 圖2是本發明的優選實施例中所用的金納米棒的SEM圖。
[0031] 圖3是本發明的優選實施例中當靶分子濃度為100nM時的磁珠探針-靶分子-標 記探針復合物的SEM圖。
[0032] 圖4是本發明的優選實施例中的金納米棒在暗場中的圖像的局部放大圖。
[0033] 圖5是本發明的優選實施例中的靶分子濃度與金納米棒平均數目關系的定標曲 線圖。
【具體實施方式】
[0034] 下面對照附圖并結合優選的實施方式對本發明作進一步說明。
[0035] 本發明提供一種靶分子濃度的檢測方法，包括如下步驟：
[0036] (1)將第一探針分子偶聯到磁珠表面形成磁珠探針，將第二探針分子偶聯到標記 粒子表面形成標記探針；
[0037] (2)在反應容器中，將所述磁珠探針和靶分子的溶液混合，所述靶分子與所述第一 探針分子反應，所述靶分子被捕獲至所述磁珠探針的表面形成靶分子-磁珠探針復合物；
[0038] (3)將所述標記探針加入所述反應容器，所述靶分子與所述第二探針分子結合，形 成磁珠探針-靶分子-標記探針復合物；
[0039] 或者分別將所述步驟（2)和（3)替換為如下步驟（2'）和（3'），
[0040] (2'）在反應容器中，將所述標記探針和靶分子的溶液混合，所述靶分子與所述第 二探針分子反應，所述靶分子被捕獲至所述標記探針的表面；
[0041] (3'）將所述磁珠探針加入所述反應容器，所述靶分子與所述第一探針分子結合， 形成磁珠探針-靶分子-標記探針復合物；
[0042] (4)將未參與反應的所述標記探針除去；
[0043] (5)在經過步驟（4)后的反應容器中加入洗脫液，使得所述磁珠探針-靶分子-標 記探針復合物發生結構解離，解離成所述磁珠探針、所述靶分子和所述標記探針；
[0044] (6)吸取經過步驟（5)后的溶液在載玻片上制成樣本，在顯微鏡下對所述標記探 針進行計數并計算所述溶液中總的標記探針的數量，通過所述總的標記探針的數量計算所 述革分子的濃度。
[0045] 其中，標記粒子是指在顯微鏡下可以單個計數的粒子。本發明的檢測原理流