弧菌檢測引物組及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物檢測技術領域，特別涉及一種弧菌檢測引物組及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 弧菌是一類廣泛分布于海洋環境的嗜鹽性革蘭氏陰性桿菌，隸屬弧菌科，弧菌屬， 具有豐富的多樣性。現在有10多種是水產養殖中的病原菌，包括河流弧菌、鰻弧菌、溶藻弧 菌等。河流弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌均為條件致病菌，當水產養殖動物在不良的環境條件 下，遭遇不利刺激或是受傷時，會誘發疾病的產生。
[0003] 隨著人工養殖迅速發展，養殖水域生態變化，弧菌病已經成為海水養殖動物主要 的細菌性病害之一。具有流行廣、發病率高、危害大、死亡率高等特點，給魚、蝦、蟹及貝類等 海水動物的養殖造成了巨大的影響。有研究表明：當水中弧菌的數量為10 3-104cfu/mL時對 蝦的紅腿病癥狀明顯加重，cfu/mL即每毫升樣品中含有的細菌群落總數。河流弧菌、鰻孤菌 和溶藻弧菌能引起世界范圍內的50多種淡海水養殖魚類及其它養殖動物發生弧菌病。很 多研究表明，這三種弧菌是多種養殖對蝦感染發病的重要原因。可以引起對蝦紅腿、黃鰓、 斷須、額劍和尾部潰爛；對外界反應遲鈍；部分蝦體發黑和肌肉白濁。河弧菌腸、溶藻弧菌 還能使人治病，引起散發性腹瀉。對弧菌引起的疾病的防治主要采取"預防為主、重點監測、 防治結合"的綜合措施，有效地檢測弧菌的方法將為弧菌的預防提供基本保障。
[0004] PCR檢測法是檢測弧菌的有效方法之一，但由于目前PCR檢測的特異性不夠，對弧 菌的檢測容易受到不同致病菌或其他因素的干擾，容易產生非特異性擴增，更加無法對多 種弧菌進行同時檢測，且檢測靈敏度有限，當弧菌含量較低時無法及時檢測出來，造成檢測 效率偏低、準確性不夠。
【發明內容】
[0005] 有鑒于此，本發明提供了一種特異性強、靈敏度高的弧菌檢測引物組及檢測方法。
[0006] 本發明第一方面提供了檢測弧菌的引物組，包括以下一對或多對引物：
[0007] toxR基因引物對：
[0008] 上游引物 toxR-F 序列為：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，即序列表 SEQ ID No. 1 ;
[0009] 下游引物 toxR-R 序列為：GTCGTAAACAAAATGACACAA，即序列表 SEQ ID No. 2 ;
[0010] flaA基因引物對：
[0011] 上游引物 flaA-F 序列為：TTACGCAGAAGCGGTGAT，即序列表 SEQ ID No. 3 ;
[0012] 下游引物 flaA-R 序列為：GCTGITGGATGAAGGGTC，即序列表 SEQ ID No. 4 ;
[0013] pyrH基因引物對：
[0014] 上游引物 pyrH-F 序列為：AAAGAACTGGITGAACTGGGTG，即序列表 SEQ ID No. 5 ;
[0015] 下游引物 pyrH-R 序列為：CCATCAACITTCGTCGCTTT，即序列表 SEQ ID No. 6。
[0016] 本發明第二方面提供了一種檢測弧菌的方法，所述方法包括使用以下一對或多對 引物對模板進行PCR擴增的步驟：
[0017] toxR基因引物對：
[0018] 上游引物 toxR-F 序列為：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，即序列表 SEQ ID No. 1 ;
[0019] 下游引物 toxR-R 序列為：GTCGTAAACAAAATGACACAA，即序列表 SEQ ID No. 2 ;
[0020] flaA基因引物對：
[0021] 上游引物 flaA-F 序列為：TTACGCAGAAGCGGTGAT，即序列表 SEQ ID No. 3 ;
[0022] 下游引物 flaA-R 序列為：GCTGITGGATGAAGGGTC，即序列表 SEQ ID No. 4 ;
[0023] pyrH基因引物對：
[0024] 上游引物 pyrH-F 序列為：AAAGAACTGGITGAACTGGGTG，即序列表 SEQ ID No. 5 ;
[0025] 下游引物 pyrH-R 序列為：CCATCAACITTCGTCGCTTT，即序列表 SEQ ID No. 6。
[0026] 本發明的有益效果是：本發明分別以河流弧菌toxR基因，鰻弧菌的flaA基因和 溶藻弧菌的pyrH基因設計引物，采用PCR方法對水環境中弧菌進行檢測，特異性強，并且 可以快速方便地確定致病菌的種類，實現對弧菌中的河流弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌的同時 檢測及單獨檢測，提高了鑒定效率。本發明是直接利用活菌作為模板構建PCR體系，省去 了從細菌中提取DNA的步驟，操作更簡單方便，成本更低。檢測結果準確且靈敏度高，對 弧菌中的河流弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌可檢測出的最低濃度依次達到5.21 X102cfU/mL、 2. 70X 104cfu/mL、2. 48X 102cfu/mL，對防止海水養殖動物主要細菌性病害之一的弧菌病具 有重要意義。
【附圖說明】
[0027] 圖1為toxR基因引物對、flaA基因引物對、pyrH基因引物對的特異性檢驗結果 示意圖；其中，M為2000bp DNA分子量標準；1為河流弧菌模板與河流弧菌toxR引物對擴 增結果；2為鰻弧菌模板與河流弧菌toxR引物對擴增結果；3為溶藻弧菌模板與河流弧菌 toxR引物對擴增結果；4為副溶血弧菌模板與河流弧菌toxR引物對擴增結果；5為鰻弧菌 模板與鰻弧菌flaA引物對擴增結果；6為河流弧菌模板與鰻弧菌flaA-F引物對擴增結果； 7為溶藻弧菌模板與鰻弧菌flaA引物對擴增結果；8為副溶血弧菌模板與鰻弧菌flaA引物 對擴增結果；9為溶藻弧菌模板與溶藻弧菌pyrH引物對擴增結果；10為河流弧菌模板與溶 藻弧菌pyrH引物對擴增結果；11為鰻弧菌模板與溶藻弧菌pyrH引物對擴增結果；12為副 溶血弧菌活菌稀釋液與溶藻弧菌pyrH引物對擴增結果。
[0028] 圖2為對河流弧菌的靈敏度檢測結果示意圖；其中，M為2000bp DNA分子量標準； 1的河流弧菌濃度為5. 21 X 106cfu/mL ;2的河流弧菌濃度為5. 21 X 105cfu/mL ;3的河流弧 菌濃度為5. 21 X 104cfu/mL ;4的河流弧菌濃度為5. 21 X 103cfu/mL ;5的河流弧菌濃度為 5. 21 X 102cfu/mL ;6的河流弧菌濃度為5. 21 X lC^cfu/mL ;7的河流弧菌濃度為5. 21cfu/ mL ;8為空白對照組，即不含河流弧菌。
[0029] 圖3為對鰻弧菌的靈敏度檢測結果示意圖；其中，M為2000bp DNA分子量標準；1 的鰻弧菌濃度為2. 70X 107cfu/mL ;2的鰻弧菌濃度為2. 70X 106cfu/mL ;3的鰻弧菌濃度為 2. 70X 105cfu/mL ;4 的鰻弧菌濃度為 2. 70X 104cfu/mL ;5 的鰻弧菌濃度為 2. 70X 103cfu/ mL ;6的鰻弧菌濃度為2. 70X 102cfU/mL ;7為空白對照組，即不含鰻弧菌。
[0030] 圖4為對溶藻弧菌的靈敏度檢測結果示意圖；其中，M為2000bp DNA分子量標 準；1的溶藻弧菌濃度為2.48X107cfu/mL;2的溶藻弧菌濃度為2.48X 106cfu/mL;3的 溶藻弧菌濃度為2. 48X 105cfU/mL ;4的溶藻弧菌濃度為2. 48X 104cfU/mL ;5的溶藻弧菌 濃度為2.48X 103cfu/mL ;6的溶藻弧菌濃度為2.48X 102cfu/mL ;7的溶藻弧菌濃度為 2. 48X lOkfu/mL ;8為空白對照組，即不含溶藻弧菌。
[0031] 圖5為同時對河流弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌中的任意兩種弧菌或三種弧菌進行檢 測的結果示意圖；其中，M為2000bp DNA分子量標準；1為flaA基因引物對、toxR基因引物 對和pyrH基因引物對對PCR模板進行多重PCR擴增的結果；2為f laA基因引物對和toxR 基因引物對對PCR模板進行雙重PCR擴增的結果；3為toxR基因引物對和pyrH基因引物對 對PCR模板進行雙重PCR擴增的結果；4為f laA基因引物對和pyrH基因引物對對PCR模 板進行雙重PCR擴增的結果；5為空白對照，即不采用引物進行PCR擴增的結果。
【具體實施方式】
[0032] 本發明第一方面提供了檢測弧菌的引物組，包括以下一對或多對引物：
[0033] toxR基因引物對：
[0034] 上游引物 toxR-F 序列為：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，如序列表 SEQ ID No. 1 所示；
[0035] 下游引物 toxR-R 序列為：GTCGTAAACAAAATGACACAA，如序列表 SEQ ID No. 2 所示；
[0036] flaA基因引物對：
[0037] 上游引物 flaA-F 序列為：TTACGCAGAAGCGGTGAT，如序列表 SEQ ID No. 3 所示；
[0038] 下游引物 flaA-R 序列為：GCTGITGGATGAAGGGTC，如序列表 SEQ ID No. 4 所示；
[0039] pyrH基因引物對：
[0040] 上游引物pyrH-F序列為：AAAGAACTGGITGAACTGGGTG，如序列表 SEQ ID No. 5 所示；
[0041] 下游引物 pyrH-R 序列為：CCATCAACITTCGTCGCTTT，如序列表 SEQ ID No. 6 所示。
[0042] 本發明第二方面提供了一種檢測弧菌的方法，其特征在于：所述方法包括使用以 下一對或多對引物對模板進行PCR擴增的步驟：
[0043] toxR基因引物對：
[0044] 上游引物 toxR-F 序列為：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，如序列表 SEQ ID No. 1 所示；
[0045] 下游引物 toxR-R 序列為：GTCGTAAACAAAATGACACAA，如序列表 SEQ ID No. 2 所示；
[0046] flaA基因引物對：
[0047] 上游引物 flaA-F 序列為：TTACGCAGAAGCGGTGAT，如序列表 SEQ ID No. 3 所示；
[0048] 下游引物 flaA-R 序列為：GCTGITGGATGAAGGGTC，如序列表