一種同時(shí)檢測(cè)弧菌屬細(xì)菌和鮰愛(ài)德華氏菌的試劑盒和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù)，特別是同時(shí)檢測(cè)弧菌屬細(xì)菌和鮰愛(ài)德華氏菌的 試劑盒和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃顙魚屬于鲇形目，鰉科，黃顙魚屬，又名黃辣丁，其肉質(zhì)細(xì)嫩、脂肪含量低、蛋白 含量高而深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度的提高，使得養(yǎng)殖環(huán)境不 斷惡化，養(yǎng)殖過(guò)程中不斷爆發(fā)病害，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。其中弧菌屬細(xì)菌、鮰愛(ài)德 華氏菌已發(fā)展成為黃顙魚的主要致病原。
[0003]鮰愛(ài)德華氏菌，屬于腸桿菌科愛(ài)德華氏菌屬細(xì)菌，以會(huì)引起黃顙魚"裂頭癥";弧菌 屬細(xì)菌中，如鰻弧菌、擬態(tài)弧菌等，引起的黃顙魚弧菌病，與鮰愛(ài)德華氏菌引起的癥狀相似。
[0004]目前，對(duì)弧菌屬細(xì)菌和鮰愛(ài)德華氏菌的檢測(cè)均是分別檢測(cè)，一次只能檢測(cè)一種病 原體，不利于混合感染的檢測(cè)，且需要大批量的樣品進(jìn)行檢測(cè)，工作量較大，成本也較高。
[0005]目前，未見同時(shí)檢測(cè)弧菌屬細(xì)菌和鮰愛(ài)德華氏菌的報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種同時(shí)檢測(cè)弧菌屬細(xì)菌和鮰愛(ài)德華氏菌的試 劑盒和檢測(cè)方法。
[0007] 本發(fā)明首先提供了SEQIDNO. 1~2與SEQIDN0. 3~4所示的引物對(duì)。
[0008] 本發(fā)明還提供了SEQIDNO. 1~2和SEQIDN0. 3~4所示的引物對(duì)在制備同時(shí) 檢測(cè)弧菌屬細(xì)菌和鮰愛(ài)德華氏菌的試劑中的用途。
[0009] 本發(fā)明同時(shí)檢測(cè)弧菌屬細(xì)菌和鮰愛(ài)德華氏菌的試劑盒，它包括SEQIDNO. 1~2 和SEQIDNO. 3~4所示的引物對(duì)。
[0010] 本發(fā)明同時(shí)檢測(cè)弧菌屬細(xì)菌和鮰愛(ài)德華氏菌的方法，它包括如下步驟：
[0011] (1)提取樣本DNA :取待檢樣本，提取其中的DNA ;
[0012] (2)基因擴(kuò)增：用權(quán)利要求4所述的試劑盒對(duì)待檢樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增；
[0013] (3)結(jié)果檢測(cè)：對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。
[0014] 其中，所述待檢樣本為養(yǎng)殖水體。
[0015] 本發(fā)明提供的試劑盒和方法可以同時(shí)分別擴(kuò)增弧菌屬細(xì)菌和鮰愛(ài)德華氏菌的基 因片段，實(shí)現(xiàn)了在同一反應(yīng)體系中一步檢測(cè)兩種病原菌，且二者之間不會(huì)相互影響，特異性 強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短，步驟簡(jiǎn)單，工作量下，成本低廉，用于快速檢測(cè)養(yǎng)殖水體，可及時(shí)有效 地預(yù)防魚病的發(fā)生，具有良好的應(yīng)用前景。
[0016] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要 求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1雙重PCR引物測(cè)試電泳圖。1 :Marker I ;2 :空白對(duì)照；3 :愛(ài)德華氏菌；4 :弧 菌；5 :愛(ài)德華氏菌+弧菌；6 :愛(ài)德華氏菌+弧菌
[0018] 圖2雙重PCR特異性測(cè)試電泳圖。1 :Marker I ;2 :無(wú)乳鏈球菌；3 :海豚鏈球菌；4 : 熒光假單胞菌；5 :嗜水氣單胞菌；6 :柱狀黃桿菌；7 :標(biāo)準(zhǔn)豚鼠氣單胞菌；8 :柱狀黃桿菌；9 : 沙門氏菌；10 :芽孢桿菌；11 :溫和氣單胞菌；12 :嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌；13 :副溶血弧菌；14 : 陽(yáng)性樣品。
[0019]圖 3 雙重 PCR 靈敏度測(cè)試電泳圖。1 :100 ;2 :10 S3 :10 2;4 :10 3;5 :10 4;6 :10 5; 7 :10 6;8 :10 7;9 :Marker 1〇
[0020] 圖4實(shí)際樣品檢測(cè)電泳圖。1 :陰性對(duì)照；2-4為1號(hào)魚組織：體表肌肉、體表肌肉、 腹部肌肉；5-7為3號(hào)魚組織：體表肌肉、體表肌肉、腹部肌肉；8-10為2號(hào)魚組織：體表肌 肉、體表肌肉、腹部肌肉；11 :Marker I。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 一、實(shí)驗(yàn)材料和儀器
[0022] 1. 1細(xì)菌菌株
[0023] 無(wú)乳鏈球菌（通威動(dòng)物保健研究所分離、保存）、海豚鏈球菌（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)分離， 通威動(dòng)物保健研究所保存）、熒光假單胞菌（中科院水生所，56-12-10)、嗜水氣單胞菌（四 川農(nóng)業(yè)大學(xué)分離，通威動(dòng)物保健研究所保存）、柱狀黃桿菌（中科院水生所G4)、標(biāo)準(zhǔn)豚鼠氣 單胞菌（中科院水生所，DMA1-A)、沙門氏菌（ATCC 13311)、芽孢桿菌（CICC 1. 126)、溫和 氣單胞菌（ATCC 43979)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)分離，通威動(dòng)物保健研究所保 存）、愛(ài)德華氏菌（ATCC 33202)、副溶血弧菌（CICC 10552)。
[0024] 1. 2主要儀器和試劑
[0025]普通 PCR 儀（Mycycler，Bio-RAD)、凝膠呈像系統(tǒng)（universal H00D-SN，北京 六一）、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（KDC-160HR，科大創(chuàng)新）、電泳儀（Power PAC 3000，Bi〇-RAD)、 電熱恒溫?fù)u床（SKY-211B，上海蘇坤）、微量進(jìn)樣器（10yL、100yL、200 yL、1000 yL， Eppendorf)、超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州凈化）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（SPX-150B，上海浦東榮 豐）。
[0026] 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；2XPCR MIX(天根生化科 技有限公司）、Greenview (Bio BRK)、瓊脂糖（Sigma)〇
[0027] 實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)
[0028] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0029] 1、PCR引物設(shè)計(jì)與合成
[0030] 根據(jù)弧菌屬細(xì)菌共有的rpoA基因序列以及鮰愛(ài)德華氏菌磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因 序列，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物（表1)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0031] 表1PCR引物資料
[0032]
[0033] 2、模板制備
[0034] 活化愛(ài)德華氏菌、副溶血弧菌，并使用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒提取。
[0035] 3、PCR 擴(kuò)增
[0036] 以步驟2提取的DNA作為模板，陰性對(duì)照的模板為ddH20,取步驟1中的兩對(duì)引物 按照下列體系和程序分別擴(kuò)增：
[0037] PCR 反應(yīng)體系（20 y 1):
[0038]
[0039] PCR反應(yīng)程序：
[0040] 混勻PCR反應(yīng)體系后，置于PCR儀中，95°C預(yù)變性4min后，進(jìn)行如下循環(huán)：
[0041] 94 °C 30sec
[0042] 58 °C 30sec
[0043] 72 °Clmin
[0044] 35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。
[0045] 4、結(jié)果檢測(cè)
[0046] 采用1. 5%的瓊脂糖凝膠，在恒壓100V條件下電泳60min，置于凝膠成像系統(tǒng)下觀 察PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0047] 二、結(jié)果
[0