的條件下繼續(xù)培養(yǎng)6天，并每天進(jìn)行離心收獲，檢測微藻的生物質(zhì)濃度和油脂含量，結(jié)果如圖2所示，由此確定最佳繼續(xù)培養(yǎng)時間。從圖2中可以看出，微藻生物質(zhì)濃度隨著繼續(xù)培養(yǎng)時間的延長而緩慢升高，說明超聲未對微藻產(chǎn)生不利影響，其油脂含量在第2天時達(dá)到最大值(37.1%?39.6% )，繼續(xù)培養(yǎng)則導(dǎo)致了油脂含量的降低，到6天后得到的油脂含量為21.8%?23.5%，而且油脂產(chǎn)率也會減少，由此確定最佳繼續(xù)培養(yǎng)時間為2天。
[0030]根據(jù)實驗結(jié)果確定經(jīng)過20分鐘的超聲刺激，再繼續(xù)培養(yǎng)2天時間的方案最終得到的油脂含量最高(37.1%?39.6% )，相比對數(shù)末期提高了約67.8% ;油脂產(chǎn)率最大為25.3?25.9mg/L，相對于對數(shù)期末期提高了約48.7%。在實施例中，設(shè)定了空白對照組，即沒有經(jīng)過超聲刺激的微藻培養(yǎng)6天后油脂含量為26.2?27.5%，說明通過微藻自身在穩(wěn)定期生長進(jìn)行油脂積累效率較低。
[0031]上述實施例中測定微藻油脂含量的方法如下:
[0032]利用離心機(jī)將藻液于4000r/min，4°C下離心收獲，獲得的藻泥在冰箱內(nèi)冷凍成塊，然后用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，將干燥后的微藻在研缽中磨成粉末，并放入烘箱中烘干后保存待用。
[0033]1.稱取約0.1g干藻粉(Hi1)于50ml離心管中，加入1ml氯仿/甲醇(2:1)溶液，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎(處理)1min(頻率為20% );
[0034]2.將混合物在4000r/min下離心lOmin，離心結(jié)束后混合物分兩相，將上清液轉(zhuǎn)移到60mL的分液漏斗中，再往離心管中加入1ml氯仿/甲醇(2:1)溶液，并利用超聲和離心按步驟1、2重復(fù)整個提取過程；
[0035]3.根據(jù)油脂提取液體積，投加0.9%的氯化鈉溶液(加入氯化鈉溶液體積為油脂提取液體積的1/5，約3?4mL氯化鈉溶液)，充分搖勾Imin,并靜置15min待液體分層；
[0036]4.測量低相溶液體積V，并取5mL低相溶液于1mL玻璃試管(m。)中，用氮?dú)獯蹈桑瑢⒉ＡЧ芊胖糜?0°C烘箱中烘至恒重(m2，約30分鐘)。
[0037]油脂含量:Lff(%) = (Hi2Ii1) XVX 100/(5X110 ；
[0038]式中:LW—基于干重下的油脂含量％，g/g ;
[0039]Iii1一藻粉干重，g ；
[0040]m2—帶有油脂的1mL玻璃管干重，g ;
[0041]Hi0-1OmL 玻璃管干重，g ；
[0042]V一低相油脂的體積，mL。
[0043]最終實驗數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明所提供的利用超聲刺激促進(jìn)對數(shù)期末期的四尾柵藻積累油脂的方法，可實現(xiàn)油脂在2天內(nèi)快速積累，使油脂含量顯著提高，同時可保證不影響微藻的生物質(zhì)濃度，達(dá)到最大的油脂產(chǎn)率，可以作為生產(chǎn)生物柴油或其他生物能源生產(chǎn)的原料。本發(fā)明方法培養(yǎng)的微藻由于能大幅度提高其油脂含量，生產(chǎn)的生物柴油不含硫，燃燒時不排放有毒害氣體，排入環(huán)境中也可被微生物降解，不污染環(huán)境。
[0044]實施例2
[0045]本發(fā)明涉及一種利用超聲刺激微藻快速積累油脂、提高油脂產(chǎn)率的微藻培養(yǎng)方法。
[0046]利用BGll培養(yǎng)基在溫度20°C，曝氣量500mL/min，光照強(qiáng)度50001ux的連續(xù)光照條件下培養(yǎng)微藻。所培養(yǎng)的微藻為四尾柵藻，來自山東省環(huán)境科學(xué)工程技術(shù)研究中心，已保藏于中國科學(xué)院淡水藻種庫，保藏號為FACHB-1768。經(jīng)過10天培養(yǎng)以后微藻達(dá)到對數(shù)生長期末期，此時微藻的生物質(zhì)濃度達(dá)到最高為0.99?1.llg/L，油脂含量為22.3%?25.3%。
[0047]進(jìn)行超聲刺激條件的優(yōu)化，將對數(shù)期末期的四尾柵藻放置于超聲環(huán)境中(150W，30kHz)，超聲處理不同時間(0、5、10、15、20和40分鐘)，然后將微藻重新放置于同步驟I的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)2天，并于收獲后檢測微藻的生物質(zhì)濃度和油脂含量，處理30分鐘后，然后將微藻重新放置于同步驟I的條件下繼續(xù)培養(yǎng)2天，其油脂含量達(dá)到最大值。
[0048]上述實施例中測定微藻油脂含量的方法如下:
[0049]利用離心機(jī)將藻液于3500r/min，6°C下離心收獲，獲得的藻泥在冰箱內(nèi)冷凍成塊，然后用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，將干燥后的微藻在研缽中磨成粉末，并放入烘箱中烘干后保存待用。
[0050]實施例3
[0051]本發(fā)明涉及一種利用超聲刺激微藻快速積累油脂、提高油脂產(chǎn)率的微藻培養(yǎng)方法。
[0052]利用BGll培養(yǎng)基在溫度25± 1°C，曝氣量600mL/min，光照強(qiáng)度50001ux連續(xù)光照條件下培養(yǎng)微藻。所培養(yǎng)的微藻為魚腥藻，購買于中科院武漢淡水藻種庫。經(jīng)過11天培養(yǎng)以后微藻達(dá)到對數(shù)生長期末期，此時微藻的生物質(zhì)濃度達(dá)到最高為I?1.2g/L，油脂含量為 28%?31%。
[0053]進(jìn)行超聲刺激條件的優(yōu)化，將對數(shù)期末期的魚腥藻放置于不同功率的超聲環(huán)境中(200，350和500W，40kHz)，處理1min后將微藻重新放置于本實施例所述環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)
3天，并于收獲后檢測微藻的生物質(zhì)濃度和油脂含量。再選擇超聲處理不同時間(5、10、20和40分鐘)，固定超聲功率為200W，40kHz，然后將處理后的微藻重新放置于本實施例所述培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)3天，并于收獲后檢測微藻的生物質(zhì)濃度和油脂含量。最終在超聲功率200W、超聲時間5分鐘、繼續(xù)培養(yǎng)時間I天的條件下其油脂含量達(dá)到最大值45%?47%。且生物質(zhì)濃度并未受到明顯影響為1.3?1.45g/L0
[0054]上述實施例中測定微藻油脂含量的方法如下:
[0055]利用離心機(jī)將藻液于5000r/min，4°C下離心收獲，獲得的藻泥在冰箱內(nèi)冷凍成塊，然后用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，將干燥后的微藻在研缽中磨成粉末，并放入烘箱中烘干后保存于干燥器中待用。
[0056]上述實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動，即可做出的各種修改或變形，仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種利用超聲刺激微藻快速積累油脂的方法，其特征在于，將進(jìn)入對數(shù)生長期末期的微藻在超聲環(huán)境中處理、培養(yǎng)，即得高油脂含量微藻。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻在進(jìn)入對數(shù)生長期末期之前的培養(yǎng)條件為:以BGl I為培養(yǎng)基，在溫度20-25 °C，曝氣量500-600mL/min，光照強(qiáng)度5000-60001ux條件下培養(yǎng)微藻10-15天。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻為四尾柵藻，來自山東省環(huán)境科學(xué)工程技術(shù)研究中心，藻種已保藏于中國科學(xué)院淡水藻種庫，保藏號為FACHB-1768。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻的生長進(jìn)入對數(shù)生長期末期后，微藻的生物質(zhì)濃度為0.99?1.llg/L，油脂含量為22.3%?25.3%。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述超聲環(huán)境條件為150-200W，30-40kHz。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻經(jīng)超聲處理、培養(yǎng)后，于4-6°C、3500-4000r/min 下離心 5-lOmin。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述高油脂含量微藻的油脂含量為.37.1%?39.
【專利摘要】本發(fā)明屬于微藻生物能源研究領(lǐng)域，涉及利用超聲刺激微藻快速積累油脂的方法。在反應(yīng)器中培養(yǎng)微藻，直至所述微藻的生長進(jìn)入對數(shù)生長期末期，將上述微藻進(jìn)行在超聲環(huán)境中處理20-30min，再于培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3天，離心，即得微藻藻粉。本發(fā)明操作簡單、耗時短、效率高、易于實現(xiàn)；能夠使四尾柵藻生物質(zhì)濃度不受影響，有助于提高油脂產(chǎn)率；能促使四尾柵藻快速積累油脂，所述方法生產(chǎn)的高油脂微藻可用于提煉汽油、柴油、航空燃油，以及作為塑料制品和藥物的原料。
【IPC分類】C12R1/89, C12N13/00
【公開號】CN105132404
【申請?zhí)枴緾N201510657834
【發(fā)明人】裴海燕, 韓飛, 胡文容, 侯慶杰, 蔣麗群
【申請人】山東大學(xué)
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年10月12日