一種脂肪酶lipase6及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物化工和生物技術領域，具體涉及一種脂肪酶LIPASE6及其編碼基 因和應用。
【背景技術】
[0002] 手性化合物雖然原子組成是一樣的，但它們的立體結構卻互為鏡像，在生物學和 藥學性質上卻相差甚遠。比如L-薄荷醇具有清涼味，而D-薄荷醇則發霉味；S-天冬酰胺 是甜的，R-天冬酰胺是苦的；R型的"反應停"是孕婦用鎮痛藥和止痛藥，而S型的"反應停" 對胎兒則有致畸作用，歷史上曾出現使用反應停導致大規模新生兒畸形的事件。可見合成 手性藥物過程中，前體原料的光學純度是重要環節。
[0003] 手性化合物的合成主要有：（1)化學法，即利用對映體的物理和化學性質的差異 進行分離。通常有鹽析法、包結法、以及組合拆分。其缺點是要求對映體之間的性質差異要 大，適用的化合物不多。（2)合成法，通過設計反應來進行手性化合物的化學合成。這種方 法缺點在于反應過程通常比較劇烈，耗費能量，而且反應中使用大量有毒的有機溶劑。（3) 色譜拆分，這種方法是利用填料對手性對映體吸附性質的差異來實現，其缺點是設備昂貴， 普及性較差。
[0004]脂肪酶（Lipase，EC 3. 1. 1. 3)，又叫作三酰甘油水解酶，是一類能夠將三酰甘油水 解為甘油和脂肪酸的酶，其來源非常廣泛，微生物、植物和動物中都有存在。脂肪酶作為生 物催化劑多數可作用非天然底物，而且可拆分的底物多，立體選擇性高，不需要輔助因子， 是一種重要的手性催化劑。
[0005] 1-苯乙醇是精細化工利用中重要的骨架和中間體，在化妝品行業的香料，染料和 醫藥行業中都有較大的應用范圍。R和S兩種對映異構體各有各自的應用，R-1-苯乙醇主要 用于化妝品行業中，還可應用于變色染料、眼科防腐劑、膽固醇腸道吸收抑制劑等；S-1-苯 乙醇主要是藥物合成的前體，如左旋咪唑、（S)-異丙腎上腺素、抗抑郁藥物取舍林等。
[0006] 但是，大多數在工業中應用的脂肪酶都是源于進口，比如Novo Nordisk公司的 月旨肪酉每Novozym 435(來自Candida antarctica)，Amano Pharmaceutical公司的Lipase PS(來自Burkhold eriacepacia)，Fluka公司的Lipase A(來自Candida antarctica)等 等。這些脂肪酶價格昂貴，生產技術受到制約，因此開發具有自主產權的脂肪酶十分必要。
【發明內容】
[0007] 本發明的針對現有技術中脂肪酶價格昂貴、生產技術受到制約的不足，提供一種 新的脂肪酶LIPASE6及其編碼基因和應用。
[0008] 本發明從一株海洋放線菌（Marinactinospora thermotolerans)中開發了一種新 的脂肪酶LIPASE6及其編碼基因lipase6,構建了含有lipase6的重組表達載體和基因工程 菌，培養基因工程菌后獲得脂肪酶LIPASE6,其可應用于制備手性1-苯乙醇。
[0009] 本發明的第一個目的是提供一種脂肪酶LIPASE6,其氨基酸序列如SEQ ID N0. 2的 第45-297位氨基酸序列所示。
[0010] 本發明的第二個目的是提供一種編碼所述的脂肪酶LIPASE6的脂肪酶基因 lipase6〇
[0011] 優選，所述的脂肪酶基因lipase6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第133-894位 堿基所示。
[0012] 本發明還提供一種含有所述的脂肪酶基因lipase6的重組表達載體。所述的表達 載體，優選pET28a(+)載體。
[0013] 本發明還提供一種含有所述的脂肪酶基因lipase6的基因工程菌。所述的基因工 程菌，優選大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0014] 本發明的第三個目的是提供所述的脂肪酶LIPASE6在制備手性1-苯乙醇中的應 用。
[0015] 優選，脂肪酶LIPASE6在拆分（±)-1_苯乙醇制備得到（R)-1-苯乙醇中的應用。
[0016] 進一步優選，其步驟為：取脂肪酶LIPASE6于反應介質中，再加入（±)_1_苯乙醇 和酰基供體，進行反應，得到（R)-1-苯乙醇。
[0017] 所述的反應介質，優選為1，4-二氧六環、四氫呋喃、叔丁醇、異丙醇、二氯甲烷、甲 苯、環己烷、正己烷、正庚烷和異辛烷中的一種。
[0018] 所述的酰基供體，優選為乙酰乙烯酯、乙酸異丙烯酯、丁酸酐、丁酸、戊酸、葵酸和 乙酸乙酯中的一種。
[0019] 優選，脂肪酶LIPASE6在水解乙酸蘇合香酯制備得到（S)-1-苯乙醇中的應用。
[0020] 進一步優選，其步驟為：取脂肪酶LIPASE6于pH為6. 0-9. 5的緩沖液中，加入乙酸 蘇合香酯及其助溶劑，進行反應，得到（s)-i-苯乙醇。
[0021] 所述的助溶劑，優選為1，4-二氧六環、四氫呋喃、叔丁醇、異丙醇、二氯甲烷、甲 苯、環己烷、正己烷、正庚烷和異辛烷中的一種。
[0022] 所述的緩沖液，優選為醋酸-醋酸鈉、磷酸緩沖液、Tris-HCl和甘氨酸-NaOH溶液 中的一種。
[0023] 本發明的脂肪酶基因lipase6來自深海樣品中篩選得到的一株海洋放線菌 (Marinactinospora thermotolerans)，保存在中國科學院南海海洋研究所實驗室。本發明 用生物信息學分析的方法，從基因組測序的放線菌（M. thermotolerans)中得到脂肪酶基 因lipase6,全長為894bp (從起始密碼子到終止密碼子），編碼297個氨基酸，該基因是一 個全新的脂肪酶基因，與其它脂肪酶基因序列的最大相似度為57 %。經分析序列中包含44 個氨基酸殘基的信號肽，成熟的脂肪酶LIPASE6由253個氨基酸殘基組成。通過克隆編碼成 熟的脂肪酶LIPASE6的脂肪酶基因lipase6并將其連接表達載體pET-28a(+)后轉化大腸 桿菌BL21 (DE3)，培養并誘導表達后，得到了重組表達的脂肪酶LIPASE6。脂肪酶LIPASE6可 用于制備手性1-苯乙醇，利用重組表達的脂肪酶LIPASE6作為催化劑，制備得到了光學純 度可達99 %的（R)-1-苯乙醇（得率達85 % )和光學純度可達90 %的（S)-1-苯乙醇（得 率達65% )。脂肪酶LIPASE6在生物化工和生物醫藥等領域具有非常大的應用價值。
【附圖說明】
[0024] 圖1是不同側鏈長度的對硝基苯酚酯對脂肪酶LIPASE6酶活的影響。
[0025] 圖2是脂肪酶LIPASE6的最適pH及pH穩定性。其中，a為最適pH曲線圖，b為 pH穩定性曲線圖。
[0026] 圖3是脂肪酶LIPASE6的最適反應溫度和溫度穩定性。其中，a為最適反應溫度 曲線圖，b為溫度穩定性曲線圖。
[0027] 圖4是脂肪酶LIPASE6拆分（±)_1_苯乙醇反應產物GC圖。其中，a是標樣GC 圖，按照保留時間依次為：1，內標十二烷；2,（S)-乙酸蘇合香酯；3,（R)-乙酸蘇合香酯；4， (R)-1-苯乙醇；5,（S)-1-苯乙醇；b是脂肪酶LIPASE6拆分（±)-1_苯乙醇反應36h后的 GC圖；c是脂肪酶LIPASE6水解消旋乙酸蘇合香酯反應24h后的GC圖。
[0028] 圖5是脂肪酶LIPASE6的蛋白表達純化情況。其中，M為蛋白Marker，1為未經 IPTG誘導的含有pET-28a(+)-lipase6的大腸桿菌BL21(DE3)，2為經IPTG誘導的含有 pET-28a(+)-lipase6的大腸桿菌BL21 (DE3)，3為Ni柱純化后得到的脂肪酶LIPASE6。
【具體實施方式】
[0029] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0030] 下列實例中未具體注明的實驗方法，均可按照常規方法進行，或按照所用產品生 產廠商的使用說明。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可通過商業途徑 得到。
[0031] 本發明的脂肪酶基因lipase6來自深海樣品中篩選得到的一株海洋放線菌 (Marinactinospora thermotolerans)，保存在中國科學院南海海洋研究所實驗室。
[0032] 實施例1:脂肪酶基因lipase6引物設計及開放閱讀框邊界確定
[0033] 提取海洋放線菌（M. thermotolerans)的基因組DNA，經16S rRNA驗證無誤后，交 至上海美吉生物科技有限公司測序。利用生物信息學手段對基因組進行注釋，分析其中的 脂肪酶基因，確定了其中脂肪酶基因lipase6的開放閱讀框，其