一種促進三角褐指藻中巖藻黃素和/或脂質積累的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及三角褐指藻，尤其是涉及一種促進三角褐指藻中巖藻黃素和/或脂質 積累的方法。
【背景技術】
[0002] 巖藻黃素（fucoxanthin)是一類廣泛存在于褐藻和硅藻中的類胡蘿卜素。這種色 素不僅存在于海帶、裙帶菜等巨藻中，在微藻中也有發現，尤其以硅藻中含量最為豐富。其 分子結構中含有不同尋常的共輒雙鍵和5, 6-單環氧基，這種結構使其具有抗癌、抗肥胖、 抗炎癥、抗糖尿病以及抑制血管增生的作用。
[0003] 人類的生存和發展離不開能源，由于石油、煤炭等傳統化石燃料的有限性和不可 再生性，導致化石燃料日益枯竭，并造成了嚴重的環境問題，尋找綠色可再生能源迫在眉 睫。在眾多生物燃料中，微藻具有生長周期短、光合效率高、生物量高、油脂含量高等優點， 被認為是生物柴油的最佳選擇之一。限制微藻生物柴油實現商業化生產的根本原因是生產 成本高，微藻生物量及油脂含量是影響微藻生物柴油生產成本的關鍵因素。因此，選擇合適 的微藻并提高培養微藻的生物量、油脂含量及產量是推動微藻生物柴油生產的有效對策。
[0004]三角褐指藻為真核單細胞海洋微藻，屬于硅藻門、羽紋綱、褐指藻目、褐指藻科、褐 指藻屬。生長速度快，適應范圍廣，富含豐富的蛋白質、脂肪、多糖等生物活性物質，脂質含 量尤其豐富。Kim等發現在三角褐指藻中的巖藻黃素的含量要比巨藻中的還要高，因此三角 褐指藻被認為是產巖藻黃素的商業藻種。
[0005] 2, 4_表油菜素內酯（2, 4-Epibrassinolide，EBR)作為綠色環保型植物生長調節 劑，具有高效、廣譜、無毒等特點，它最突出的生理作用就是促進植物細胞的伸長與分裂。一 些學者認為EBR在植物體內單一或協同其他激素對細胞分裂等過程起作用，它通過調節細 胞分裂素、赤霉素、脫落酸等的水平來增加細胞質中Ca 2+濃度，進而控制細胞分裂。EBR作 為一種誘導子能夠誘導轉錄植物中的特定基因，從而提高植物的次生代謝產物。或者在細 胞內作為第二信使而直接產于胞內信號的轉導，或通過對其它信號通路的調節間接影響細 胞生物的活動。目前，國內外還沒有公開任何關于利用2, 4-表油菜素內酯來促進三角褐指 藻中巖藻黃素和/或脂質積累的相關研究報道。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是提供一種促進三角褐指藻中巖藻黃素和/或脂質 積累的方法，該方法通過在培養基中添加一定量的2, 4-表油菜素內酯，可有效提高三角褐 指藻中巖藻黃素和/或脂質積累速度，顯著提高三角褐指藻中巖藻黃素和/或脂質的含量， 具有操作簡單，成本低，生產周期短。
[0007]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種促進三角褐指藻中巖藻黃素 和/或脂質積累的方法，將數生長期的三角褐指藻按10%的體積比接種到海水培養液中后， 加入2, 4-表油菜素內酯使其終濃度為0. 05-0. 15 mg/L，于培養溫度為20°C，光照強度為 5000 lx，光照周期為12 h/12 h，每天充分搖瓶3次，共培養10 d即可獲得巖藻黃素和/或 脂質含量較高的三角褐指藻。
[0008] 所述的海水培養液將滅菌的寧波大學3號母液按1:1000的比例加入到滅菌的海 水中搖晃均勻后得到，所述的寧波大學3號母液的配方為：KN0 3 10g，KH2P04 lg，FeS04*7H20 0.25g，MnS04 0 . 0 2 5g，EDTANa2 lg，VBi 0.0006, dH20 100ml。
[0009] 所述的2, 4-表油菜素內酯在海水培養液中的終濃度為0.05 mg/L。該濃度為巖藻 黃素積累的最適濃度，可使巖藻黃素含量達到最大。
[0010] 所述的2, 4-表油菜素內酯在海水培養液中的終濃度為0. 1 mg/L。該濃度為脂質 積累的最適濃度，可使脂質含量達到最大。
[0011] 與現有技術相比，本發明的優點在于：本發明一種促進三角褐指藻中巖藻黃素和 /或脂質積累的方法，通過濃度為0. 05-0. 15 mg/L的2, 4-表油菜素內酯對三角褐指藻的 誘導處理，使三角褐指藻生物量、巖藻黃素含量、脂質含量及產量增加顯著，其原因可能是 2, 4-表油菜素內酯作為新型植物生長調節物質，可通過促進光合作用從而提高藻類細胞生 長，也可影響藻類脂類代謝、糖類代謝和次生代謝調控，從而促進巖藻黃素含量和脂質含量 的上升。該發明操作簡單，成本低，生產周期短，無有害物質產生，適于批量處理和工廠化生 產，為巖藻黃素/微藻產油業的開發利用提供了技術支持。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發明三角褐指藻光密度-細胞密度曲線； 圖2為利用不同濃度EBR處理三角褐指藻后生長曲線圖； 圖3為利用不同濃度EBR處理三角褐指藻后生物量及比生長速率變化； 圖4為利用0. lmg/L EBR處理后巖藻黃素粗提液的掃描光譜圖； 圖5為巖藻黃素標準品的掃描光譜圖。
【具體實施方式】
[0013] 以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0014] 一、實驗方法 1、三角褐指藻的培養 三角褐指藻由寧波大學海洋生物工程重點實驗室微藻室提供。天然海水經沉淀和脫脂 棉過濾后，高溫滅菌。待冷卻至室溫后，將滅菌的寧波大學3號母液按1 :1000的比例加入 到滅菌的海水中搖晃均勻后得到海水培養液，備用。寧波大學3號母液的配方為：KN0310g， KH2P04 lg，FeS04? 7H20 0?25g，MnS040?025g，EDTANa2lg，VBi 0?0006,dH20 100ml 〇 將對 數生長期的三角褐指藻按10%的體積比接種到海水培養液中，并置于光照培養箱中培養， 培養溫度為20°C，光照強度為5000lx，光照周期為12 h/12 h (光/暗)，每天充分搖瓶3 次，并隨機交換位置以減少光照差異，共培養10 d。
[0015] 2、三角褐指藻光密度回歸方程和生長曲線測定 取5 mL對數生長期的三角褐指藻藻液，倍比稀釋，采用分光光度法測定各組稀釋液的 光吸收值〇D_，同時用血球計數法計算各組樣品中三角褐指藻的細胞密度。根據測定結果 以光吸收值〇D6S。為X軸，三角褐指藻細胞密度為Y軸，繪制光密度-細胞密度標準曲線，并 求得回歸方程。培養過程中每天定時從不同質量濃度EBR處理的培養液中取3 mL藻液，測 定〇D_值，并根據上述光密度-細胞密度回歸方程，計算各樣品中三角褐指藻的細胞密度， 繪出三角褐指藻生長曲線。
[0016] 通過測定倍比稀釋的三角褐指藻的藻細胞數量和0D6S。，得出光密度-細胞密度回 歸方程(如圖1所示）：y=18. 063x+0. 0047, R2=0. 9964。式中，y為每毫升藻液的細胞數量， x為0D_的值，相關系數為0. 9964。由相關系數可知，用0D _可以反映三角褐指藻的生長 情況。
[0017] 3、生物量及比生長速率的測定 取穩定期的藻液40、80、120、160、200 1^，分別加入160、120、80、40、0 11^海水培養液， 測定其〇D6S。的值。然后將這五組樣品5000 r/min離心10 min，收集藻泥，冷凍干燥48 h， 稱重，每個樣品設三個平行組。以0D6S。為X軸，生物量（g*L-l)為Y軸，繪制0D 生物量 標準曲線。根據不同濃度EBR處理下樣品的吸光值，通過該標準曲線，計算穩定期時三角褐 指藻細胞的生物量。比生長速率計算公式為y= (111財-11^。）/1'，％是接種后初始的細胞 數，Nt是經過T天后的細胞數。
[0018] 4、巖藻黃素含量及產量的測定 取一定體積的藻液，5000 r/min離心10 min，用去離子水洗滌2次后收集藻泥，冷凍干 燥后研磨得到藻粉。采用有機溶劑法提取巖藻黃素，向藻粉中加入無水乙醇，使其料液比為 l:40(g/mL)，在60°C的條件下避光靜置1 h，于5000 r/mim離心10 min，得到上清液，取沉 淀重復浸提離心取上清1次，合并兩次所得上清液，稀釋后測定樣品在445 nm處的吸光值， 按如下公式計算巖藻黃素含量： 巖藻黃素含量（mg/g) =1000A445A^P/〇41%lcni# 100 X 1000) X 100% 式中A445為巖藻黃素最大吸收峰值；N為稀釋倍數；V為粗提液總體積，mL ; I'cm為在1cm光程長的比色皿中1 g/L巖藻黃素的理論吸收值，即1600 ;M為樣品質 量g。巖藻黃素產量(mg/L ? d)=巖藻黃素質量/藻液體積*培養天數 5、脂質含量及產量的測定 脂質含量測定步驟如下，取一定體積的藻液，5000 r/min離心10 min，用去離子水洗滌 2次后收集藻泥，冷凍干燥48 h后稱重。采用Bligh-Dyer法抽提總脂，每組設三個平行。 具體步驟如下，取0. lg藻粉置于10mL離心管中，加入3. 8mL CHC13/CH30H/H20(1 :2 8)， 震蕩2min，4°C超聲提取5min，然后8000rm