一種重組細胞篩選系統及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及重組細胞篩選技術領域，具體來說，涉及一種重組細胞篩選系統及其 構建方法。
【背景技術】
[0002] 基于報告基因的篩選系統是分子生物學研究中的重要工具，在基因表達、蛋白質 互作及藥物篩選等研究中發揮著重要的作用。目前已經應用的篩選系統主要基于如下蛋白 或酶的編碼基因：0 _半乳糖苷酶（0 -Lactamase)、0 -葡萄糖苷酶（0 -glucuronidase)， 焚光素酶（luciferase)和各種焚光蛋白（fluorescent protein)等。
[0003] 但是這些篩選系統存在一定的不足之處，它們或需要額外添加前體底物，或需要 特別的硬件檢測設備。比如半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶，熒光素酶分別需要提供 X-gal，X-gluc和luciferin作為信號產生的底物，實際操作過程中往往由于底物添加不均 勻或者底物不能正常進入細胞內部從而極大地影響了篩選效果，另外這些前體底物的價格 一般較高。基于熒光素酶的篩選系統需要光子檢測設備，基于熒光蛋白的篩選系統需要特 定波長的激發光源產生設備。總之，前體底物和硬件設備的需求不但增加了篩選系統的復 雜性和篩選的假陽性，而且增加了篩選的經濟成本。
【發明內容】
[0004] 本發明提供了一種重組細胞篩選系統及其制備方法，使用該系統時無需添加前體 底物，避免了底物添加不均勻或不能正常進入細胞內部產生的問題，該系統產生的藍色色 素在可見光下用肉眼觀察就可獲得直觀的結果，使用方便且降低了篩選成本。
[0005] 本發明的一個方面，提供一種重組細胞篩選系統，包括：可組成型表達非核糖體肽 合成酶編碼基因的受體細胞和含有磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶編碼基因的質粒。
[0006] 以上所述的重組細胞篩選系統中，所述磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶編碼基因的第五 個密碼子之后插入了多克隆位點。
[0007] 以上所述的重組細胞篩選系統中，所述非核糖體肽合成酶編碼基因的序列如SEQ ID N0 :1 所示。
[0008] 以上所述的重組細胞篩選系統中，所述非核糖體肽合成酶編碼基因的啟動子序列 如 SEQ ID N0 :2 所示。
[0009] 以上所述的重組細胞篩選系統中，所述非核糖體肽合成酶編碼基因的核糖體結合 位點序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0010] 以上所述的重組細胞篩選系統中，所述受體細胞為原核細胞、真菌細胞或哺乳動 物細胞；具體地，所述受體細胞為大腸桿菌；更具體地，所述大腸桿菌為E. coli JM109。
[0011] 本發明的另一個方面，提供一種以上所述的重組細胞篩選系統的構建方法，包括 如下步驟：
[0012] (1)將含有非核糖體肽合成酶編碼基因及其啟動子和其核糖體結合位點的DNA序 列整合到受體細胞基因組中；
[0013] (2)構建含有磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶編碼基因的質粒。
[0014] 以上所述的構建方法，所述非核糖體肽合成酶編碼基因的序列如SEQIDN0 :1所 示，所述非核糖體肽合成酶編碼基因的啟動子序列如SEQIDN0 :2所示，所述非核糖體肽合 成酶編碼基因的核糖體結合位點序列如SEQIDN0 :3所示。
[0015] 以上所述的構建方法，所述受體細胞為原核細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞；具體 地，所述受體細胞為大腸桿菌；更具體地，所述大腸桿菌為E. coli JM109。
[0016] 以上所述的構建方法，其中步驟（2)中所述磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶編碼基因替 代質粒PUC19中的lacZ a基因，并將所述磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶編碼基因的第五個密碼 子之后插入了多克隆位點；具體地，所述多克隆位點來自PUC19;更具體地，所述磷酸泛酰 巰基乙胺轉移酶編碼基因來源于枯草芽孢桿菌。
[0017] 以上所述的構建方法，所述含有非核糖體肽合成酶編碼基因及其啟動子和其核糖 體結合位點的DNA序列通過大腸桿菌整合型質粒p0SIP-K0為載體整合到E. coli JM109的 基因組上，再去除P0SIP-K0來源的整合元件和抗性基因元件僅保留非核糖體肽合成酶表 達元件。
[0018] 本發明系統的構建是基于鏈霉菌來源的非核糖體肽合成酶編碼基因idgS和芽孢 桿菌來源的磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶編碼基因sfp。活性的IdgS(Holo-idgS)能夠催化 L-谷氨酰胺（L-Gln)生成藍色化合物-藍靛素（indigoidine)，而idgS的直接表達產物 (Apo-IdgS)沒有活性，需經翻譯后修飾過程（該過程由磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶催化）才 能變成活性形式，Sfp蛋白能夠完成IdgS的活化。L-谷氨酰胺（L-Gln)存在于所有細胞 內，無需外源添加，因此只要活性的IdgS純在于細胞內，該細胞就會以內源L-谷氨酰胺為 底物合成藍色化合物-藍靛素（indigoidine)，因而呈現出肉眼可見的藍色。
[0019] 另外本發明在sfp基因的第五個密碼子后同框插入多克隆位點區，并不影響sfp 的功能，并且帶有多克隆位點區的sfp為該系統的使用提供了便利。
[0020] 與傳統的篩選系統相比，本發明的系統無需添加外源底物，也無需特殊的檢測設 備，能夠快速、簡便、經濟、高效地完成篩選過程。本發明在實施例中也具體闡述了該系統的 應用實例-基因片段的克隆篩選，證明了本發明的系統可有效用于重組細胞的篩選。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發明的重組細胞篩選系統構建原理示意圖。
[0022] 圖2為本發明實施例提供的工程菌株idgSOl和idgS02構建過程示意圖。
[0023] 圖3為本發明實施例提供的E. coli idgsOl的驗證結果電泳圖；其中，泳道（1、2、 3)和泳道（4、5、6)分別對應三個隨機挑選的轉化子。
[0024] 圖4質粒pSFPHE及多克隆位點示意圖。
[0025] 圖5含有質粒pSFPHE的菌株E. coli idgS02呈現藍色表型。
[0026] 圖6為本發明實施例中GFP基因克隆篩選在可見光下的藍白斑表型。
[0027]圖7為本發明實施例中GFP基因克隆篩選在紫外燈下的表型，結果顯示白色菌落 與GFP基因的成功插入存在良好的對應關系。
【具體實施方式】
[0028] 以下結合附圖和實施例，對本發明的【具體實施方式】進行更加詳細的說明，以便能 夠更好地理解本發明的方案以及其各個方面的優點。然而，以下描述的【具體實施方式】和實 施例僅是說明的目的，而不是對本發明的限制。本發明僅以大腸桿菌為例，但是該系統在真 菌細胞及哺乳動物細胞中也有極大的應用潛力。
[0029] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0030] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0031] 實施例1、idgS密碼子的優化與全基因合成
[0032] idgS 基因（具體序列見 SEQ ID N0 :6)是本實驗室從 Streptomyces lavendulae CGMCC No. 4. 1386克隆到的一個非核糖體肽合成酶編碼基因。為了使該基因能夠在大腸桿 菌中得到更好的表達，根據大腸桿菌的密碼子使用偏好，重新設計了 idgS基因序列（命名 為idgSE。，具體序列見SEQ ID N0:1)。同時在idgS-E.rall上游，一并設計了一個強啟動子 (T5pr 〇m〇ter，具體序列見SEQ ID N0:2)和一個強核糖體結合位點（RBSs，具體序列見SEQ ID N0 :3)。包含有強啟動子和強核糖體結合位點的idgSE。命名為T5p-Rs-idgSE。，并委托由 DNA合成公司（北京擎科新業生物技術有限公司）進行全基因合成，全序列見SEQ ID N0: 4〇
[0033] 實施例2、構建工程菌株E. coli idgSOl
[0034] 如圖2所示，利用大腸桿菌整合型質粒p0SIP-K0作為載體 (St-Pierre, F. , Cui, L. , Priest, D. G. , Endy, D. , Dodd, I. B. , and Shearwin, K. E. (2013) One-step cloning and chromosomal integration of DNA. ACS synthetic biology 2, 537-541.)，將實施例1中合成的DNA片段（T5p-Rs-idgS-E。）整合到E. coli JM109的基 因組上，構建了大腸桿菌工程菌株E. coli idgSOl。
[0035] E. coli idgSOl的詳細構建過程如下：
[0036] 2. 1 合成引物 T5F-SpeI :5' -CGACTAGTAAGAATCATAAAAAAITTAITTGCT-3' 和引物 idgsmR-bamHI :5' -GGGGATCCTTATTCACCCAG-3'。
[0037] 2. 2 以合成的 DNA 片段（T5p-Rs-idgS-Ec)為模板，采用 T5F-SpeI，idgsmR-bamHI 引物進行PCR擴增，50yl擴增體系中含有如下組分：5X Phusion HF buffer 10yl， 2.5mM dNTPs 4yl，引物 l(10yM T5F-SpeI)2yl，引物 2(10yM idgsmR-bamHI)2yl，模 板（lOOng/yl T5p-Rs-idgS_Ec)liil，Phusion DNA polymerase (2U/ul) 0.5 yl，去離子水 30. 5 y 1。PCR 擴增條件如下：98°C 30 秒；98°C 10 秒，57°C 10 秒，72°C 1 分 20 秒，共 30 個 循環；72°C5分鐘。
[0038] 2. 3PCR擴增產物進行純化后，采用限制性內切酶Spel (購自Takara Bio Company)、BamHI (購自Takara Bio Company)進行雙酶切，50 y 1酶切體系包含如下組分： 10X K buffer 5yl，PCR 擴增產物（500ng/yl)5yl，SpeI(10U/yl)lyl，BamHI(10U/ yl)lyl，去離子水：38yl。酶切條件為：37°C，3小時。
[0039] 2. 4相似地，質粒載體p0SIP-K0采用SpeI、BamHI進行雙酶切處理，酶切條件同上。
[0040] 2. 5將上述酶切產物純化后進行連接反應。20yl連接反應體系如下：10X T4DNA 連接酶 buffer 2 y 1，T5p-Rs-idgS-Ec 酶切產物（500ng/ y 1)4 y 1，pOSIP-KO 酶切產物 (500ng/ y 1) 4 y 1，T4DNA連接酶2 y 1，去離子水：8 y 1。連接反應條件為16°C，2小時。
[0041] 2. 6將連接產物轉化E. coli JM109(購自Takara Bio Company)感受態細胞， 轉化產物在含有卡那霉素（50μg/ml)的LB固體培養基上進行篩選（Sambrook J. et al. Molecular cloning, Laboratory manuals. 2001)。獲得的轉化子被命名為 E. coli idgsOl。
[0042] 2. 7E. coli idgsOl的驗證。質粒載體pOSIP-KO在大腸桿菌中有一個主要整合 位點（attBl)和一個次要整合位點（attB2)，為了確定在工程菌株E. coli idgsOl中載體 pOSIP-KO的整合位點，合成了如下引物：
[0043]P1 :5，-CTCATTCGAAACCACCCACCG-3，，
[0044]P2 :5 ' -ACTTAACGGCTGACATGG-3 '，
[0045]P3 :5 ' -ACGAGTATCGAGATGGCA-3 '，
[0046]P4 :5，-GATCATCATGTTTATTGCGTGG-3，，
[0047]SP1 :5 ' -TCCGGAATGCCTGCATTG-3 '，
[0048] SP4 :5 ' -CCCTGGAGCCAAAATATCC-3 '。
[0049] 其中Pl，P4對應基因組上attBl位點兩側的序列，SP1和SP4對應attB2位點 兩側序列。P2和P3對應載體p0SIP-K0上的序列（圖2)。以隨機挑選三個工程菌株 (E.coli idgsOl)作為模板，采用兩組混合引物（P1，P2，P3，P4)和（SP1，P2，P3，SP4)分別 進行 PCR 擴增。PCR 擴增體系（50yl)如下：10XTaq buffer 5yl，2.5mM dNTPs 4yl,引 物（10yM) (1，2,3,4)每種引物 2yl,模板（E.coli idgs01)