一種體外培養碘泡蟲的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于寄生蟲體外培養技術領域，特別是涉及到一種碘泡蟲實驗室培養方法的建立和培養條件的優化。
【背景技術】
[0002]隨著水產養殖品種結構調整的升級和名特優新品種的不斷引進，漁民獲得了較為豐厚的經濟效益，但與此同時，來自五湖四海的魚類新品種也帶來了諸多疾病，其中粘孢子蟲病尤為突出，其危害程度十分嚴重，如果防治不及時，常常引起魚類大批死亡，造成經濟損失。粘孢子蟲是魚類專有的寄生蟲，淡水魚類、海產魚類均有粘抱子蟲寄生。
[0003]國內外文獻中已記載的種類，大約1020種以上，由于大量寄生引起魚類發生嚴重的粘孢子蟲病。例如，國外流行鮭、鱒魚的打轉病(whirLing disease),病原體是腦粘體蟲(Myxosoma cerebraLis),北美、歐洲、亞洲等地廣泛流行此病，使鮭、鱒飼養業遭受極大損失；白鰱瘋狂病是杭州地區白鏈的極其嚴重的粘孢子蟲病，病原體是鰱碘泡蟲(MyxoboLus driagini);廣東鯪魚的埋坎病，病原體是野鯉碘泡蟲(MyxoboLus Koi);廣東草魚的餅形碘泡蟲病，病原體是餅形碘泡蟲(MyxoboLus artus);四川鯉魚的碘泡蟲病，病原體是宜賓碘泡蟲(新種)(MyxoboLus yibinenesis sp.nov.),使鯉魚苗種大批死亡；四川重慶白鰱粘體蟲病，病原體是變異粘體蟲(MyxoboLus varia);東北哈爾濱地區白鏈膽囊四極蟲病，由于膽汁外溢，白鰱大批死亡。此外，近年來國家現代農業產業技術體系推廣的新品種異育銀鯽“中科3號”發生的單極蟲病、喉孢蟲病的危害也是極其嚴重。
[0004]這些突出的例子，構成了中國特點的粘孢子蟲病。到目前為止，由于沒有有效的防治藥物，故還未找到有效的控制方法，已給漁業生產帶來了巨大損失。因為孢子蟲的生理特性和其它寄生蟲不一樣，其外層有寄主結締組織形成的胞囊，蟲體在胞囊里面，一般藥物很難穿透胞囊，即使穿透，藥物也很難達到有效殺滅的濃度而使蟲體死亡，大多數情況下只能殺滅一部分蟲體，大部分蟲體處于休眠狀態，待藥物失效后，孢子蟲又恢復生機，病情又重復發作，很難徹底治愈。
[0005]我國生物種類繁多，高等動物的研究早已展開，但對于粘孢子蟲學的研究則起步較晚。20世紀中期以來，謝杏人、陳啟鎏、馬成倫、李連祥等學者開始對我國粘孢子蟲學進行研究，并在粘孢子蟲分類學、生態學、病原學、免疫學等領域取得了長足的進步，《中國動物志粘體動物門粘孢子綱》等專著的出版是其中重要的成果。近些年來，國內對粘孢子蟲系統學的研究已經開展，并取得了一定的成果，但多集中在形態分類及新種鑒定，而對其體外培養報道甚少。粘孢子蟲所引起的疾病是養殖魚類的主要寄生蟲病，該病的流行和蔓延常常造成魚類大量死亡。研究粘孢子蟲的體外培養無論對查明粘孢子蟲的生活史，還是對粘孢子蟲所引發的相關疾病的防治，都具有十分重要的意義。因此現有技術當中亟需要一種新型的技術方案來解決這一問題。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是:提供一種體外培養碘泡蟲的方法，對其培養條件進行優化，使碘泡蟲在寄主之外的一個適宜環境中得以繁殖，為之后的藥效學或疫苗的研究提供大量的基礎材料，并促進碘泡蟲引發的疾病或粘孢子蟲病的進一步研究。
[0007]—種體外培養碘泡蟲的方法，其特征是:采用鯽魚肌肉勻漿為培養載體進行碘泡蟲體外培養的方法，包括以下步驟，
[0008]步驟一、抗生素的配置
[0009]在無菌操作臺上，取青霉素鈉0.96g和硫酸鏈霉素Ig溶解于10mL的經過消毒處理的去離子水中混合，采用移液管移取上述溶液SmL置于經消毒處理的玻璃瓶內，且分裝為12個玻璃瓶內，采用封口膜將12個玻璃瓶封口，置于-20 °C的冰箱內保存備用；
[0010]步驟二、鯽魚肌肉組織勻漿上清培養液的配置
[0011]取鯽魚肌肉組織5g，加入500mL過濾水，采用勻漿機將勻漿打碎后離心lOmin，取離心后上清液加入5mL抗生素保存備用；將ImL鯽魚肌肉組織勻漿上清液加入到經
0.22 μ m濾膜過濾的250mL水中，作為試驗培養液母液；
[0012]步驟三、碘泡蟲的體外培養
[0013](I)從體內含有碘泡蟲的魚中取出孢囊，用1.5mL的離心管將孢囊收集，采用試驗培養液母液進行沖洗離心至獲得孢子；
[0014](2)將孢子置于50mL細胞培養瓶中，向細胞培養瓶中加入ImL試驗培養液母液、4mL DMEM細胞培養液、50 μ L抗生素；
[0015](3)取六孔培養板，向六孔培養板的每個孔中加入100 μ L的上述培養瓶中取出的碘孢子蟲，400 μ L肌肉組織勻漿上清培養液，1500 μ L DMEM細胞培養液，400 μ L的胎牛血清，在26°C的溫度條件下連續培養；
[0016]步驟四、計數及繪制生長曲線
[0017]在所述步驟三的連續培養過程中，每間隔72小時，進行一次計數，計數時將六孔培養板中所培養的碘泡蟲混勻，并從每一培養孔中分別吸取1yL的碘泡蟲，并用細胞計數板進行計數，根據記錄的數據繪制生長曲線。
[0018]一種體外培養碘泡蟲的方法，其特征是:采用鯽魚鰓勻漿為培養載體進行碘泡蟲體外培養的方法，包括以下步驟，
[0019]步驟一、抗生素的配置
[0020]在無菌操作臺上，取青霉素鈉0.96g和硫酸鏈霉素Ig溶解于10mL的經過消毒處理的去離子水中混合，采用移液管移取上述溶液SmL置于經消毒處理的玻璃瓶內，且分裝為12個玻璃瓶內，采用封口膜將12個玻璃瓶封口，置于-20 °C的冰箱內保存備用；
[0021]步驟二、鯽魚鰓組織勻漿上清培養液的配置
[0022]取鯽魚鰓組織5g，加入500mL過濾水，采用勻漿機將勻漿打碎后離心lOmin，取離心后上清液加入5mL抗生素保存備用；將ImL鯽魚鰓組織勻漿上清液加入到經0.22 μ m濾膜過濾的250mL水中，作為試驗培養液母液；
[0023]步驟三、碘泡蟲的體外培養
[0024](I)從體內含有碘泡蟲的魚中取出孢囊，用1.5mL的離心管將孢囊收集，采用試驗培養液母液進行沖洗離心至獲得孢子；
[0025](2)將孢子置于50mL細胞培養瓶中，向細胞培養瓶中加入ImL試驗培養液母液、4mL DMEM細胞培養液、50 μ L抗生素；
[0026](3)取六孔培養板，向六孔培養板的每個孔中加入100 μ L的上述培養瓶中取出的碘孢子蟲，400 μ L肌肉組織勻漿上清培養液，1500 μ L DMEM細胞培養液，400 μ L的胎牛血清，在26°C的溫度條件下連續培養；
[0027]步驟四、計數及繪制生長曲線
[0028]在所述步驟三的連續培養過程中，每間隔72小時，進行一次計數，計數時將六孔培養板中所培養的碘泡蟲混勻，并從每一培養孔中分別吸取1yL的碘泡蟲，并用細胞計數板進行計數，根據記錄的數據繪制生長曲線。
[0029]所述步驟三中每孔培養板接種魚類碘孢子蟲密度為20ind/mL。
[0030]所述步驟三中胎牛血清的濃度為20%。
[0031]通過上述設計方案，本發明可以帶來如下有益效果:一種體外培養碘泡蟲的方法，對其培養條件進行優化，使碘泡蟲在寄主之外的一個適宜環境中得以繁殖，為之后的藥效學或疫苗的研究提供大量的基礎材料，并促進碘泡蟲引發的疾病或粘孢子蟲病的進一步研究。
[0032]本發明將寄生于魚體的寄生蟲，移到了體外進行培養，可以使碘泡蟲方面的研究不再受季節性的限制，而且在適宜的條件下可以對碘泡蟲進行長期的培養和保存。
[0033]本發明用于培養碘泡蟲