一種水溶性o-羥乙基殼聚糖納米顆粒及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒及其制備方法與應用，屬于生物醫藥領域。
【背景技術】
[0002]殼聚糖[β _(1-4) _2_氨基_2_脫氧-D-匍萄糖]是生物界中存在的陽性氨基多糖，它是由甲殼素在堿性條件下水解脫乙酰基得到的。殼聚糖分子上存在著大量的游離氨基和羥基，因此它不但具有良好的保濕性和增濕性，而且還可以通過對其進行功能化修飾，拓展殼聚糖的應用范圍；此外，它還具有無生物毒性、良好的成膜性、可生物降解性和較好的生物相容性等優點，因此近年來殼聚糖在保健食品、食品保鮮、化妝品、生物醫藥、植物病害的防治等領域顯示了其獨特的應用價值。
[0003]然而，殼聚糖作為藥物載體使用時卻受限于其水溶性差的缺點。已有大量報道表明，可通過表面修飾的方式解決上述問題。但上述方式制備的殼聚糖納米顆粒往往尺寸較大，難以進入細胞。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒及其制備方法與應用，本發明使殼聚糖水溶性提高，具有細胞毒性低，易于進入細胞。
[0005]本發明提供的水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒的制備方法，包括如下步驟:1)在酸性水溶液中，將殼聚糖氧化降解，調節體系的PH值，然后再加入環氧乙烷，發生羥乙基化反應I，得到O-羥乙基殼聚糖水溶液；
[0006]2)將所述低分子量殼聚糖水溶液與D- α -生育酚琥珀酸酯溶液混合，進行共價連接反應，得到殼聚糖衍生物納米顆粒的水溶液；
[0007]3)將所述殼聚糖衍生物納米顆粒的水溶液與環氧乙烷混合，發生羥乙基化反應II，即得到所述水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒。
[0008]上述的方法中，步驟I)中，所述酸性水溶液為乙酸水溶液或鹽酸水溶液；
[0009]所述酸性水溶液的體積分數可為I?8 %，具體可為8 % ;
[0010]所述殼聚糖與所述酸性水溶液的質量體積比可為5?20g:1L，具體可為1g:1L。
[0011]上述的方法中，所述氧化降解采用的氧化劑為高硼酸鈉或雙氧水；
[0012]所述殼聚糖與所述氧化劑的質量比可為150:5?12，具體可為25:3 ;
[0013]所述氧化降解的溫度可為40?80°C，具體可為60°C ;
[0014]所述氧化降解的攪拌速率可為200?6000r/min，具體可為1200?1500r/min ；
[0015]所述氧化降解的攪拌反應時間可為2?9h，具體可為5h ;
[0016]所述pH值可為10?12。
[0017]上述的方法中，所述殼聚糖與所述環氧乙烷的質量體積比可為3g:10?30mL，具體可為3g:20mL ；
[0018]加入所述環氧乙烷的溫度可為O?10°C，具體可為4?5°C ;
[0019]所述羥乙基化反應I的溫度可為50?70°C，具體可為60 °C ;
[0020]加入所述環氧乙烷后由O?10°C升至50?70°C的速率為8?15°C /h ;在具體反應時在4?5 °C加入所述環氧乙烷，然后以8?15°C /h速率升溫至60°C反應；
[0021]所述羥乙基化反應I的時間可為2?4d，具體可為3d ;
[0022]所述羥乙基化反應I的攪拌速度可為200?6000r/min，具體可為1200?1500r/
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[0023]上述的方法中，所述D- α -生育酚琥珀酸酯溶液(簡稱TPS)為D- α -生育酚琥珀酸酯溶于丙酮、乙醇、DMF或DMSO中制成的溶液；
[0024]所述D- α -生育酸琥珀酸酯溶液的濃度可為10?20mg/ml，具體可為10mg/ml ；
[0025]所述O-羥乙基殼聚糖與所述D- α -生育酚琥珀酸酯的質量比可為10:2?6，具體可為10:3 ；
[0026]步驟2)中，所述反應的溫度可為30?40°C，具體可為35 °C ;
[0027]所述反應的時間可為3?72h，具體可為3h ;
[0028]所述反應的攪拌速度為200?6000r/min。
[0029]上述的方法中，步驟2)中還包括將所述D- α -生育酚琥珀酸酯溶液用EDC/NHS活化的步驟，具體攪拌3h;
[0030]步驟2)還包括將反應液用丙酮透析12?72h，具體可為24h，丙酮透析的過程中更換所述丙酮至少2次；再用二次水透析2?4d，具體可為2d，所述水透析的過程中更換所述水4?8次，然后收集透析袋內的所述殼聚糖衍生物的水溶液；
[0031]所述殼聚糖衍生物納米顆粒的粒徑可為90?150nm，具體可為80?120nm。
[0032]上述的方法中，所述殼聚糖衍生物納米顆粒與環氧乙烷的質量體積比可為3g:10?30mL，具體可為3g:20mL ；
[0033]加入所述環氧乙烷的溫度可為O?10°C，具體可為4?5°C ;
[0034]所述羥乙基化反應II的溫度可為40?60°C，具體可為50 °C ;
[0035]加入所述環氧乙烷后由O?10°C升至50?70°C的速率可為8?15°C /h ;在4?5°C將所述環氧乙烷加入，然后緩慢升溫至50°C反應；
[0036]所述羥乙基化反應II的時間可為12?36h，具體可為12h ;
[0037]所述羥乙基化反應II的攪拌速度可為200?6000r/min ;
[0038]步驟3)中所述羥乙基化反應的pH值為8?12。
[0039]本發明還提供了上述的方法制備的水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒。
[0040]所述水溶性O-輕乙基殼聚糖納米顆粒的粒徑可為20?80nm具體可為40?80nm。
[0041]上述水溶性O-輕乙基殼聚糖納米顆粒應用于制備抗癌藥物或抗癌藥物載體中；
[0042]所述癌具體為乳腺癌、人骨髓神經母細胞瘤或肝癌。
[0043]本發明具有以下優點:
[0044]1、本發明水溶性O-羥乙基殼聚糖衍生物納米顆粒在高速攪拌條件下采用氧化降解和羥乙基化修飾的方法，自組裝成納米顆粒，在該反應條件下制備的水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒不但具有良好的水溶性，且保留了 -OH和_順2活性位點。
[0045]2、本發明水溶性O-羥乙基殼聚糖衍生物納米顆粒粒徑較小，尺寸可控，控制方法簡單易行。
[0046]3、本發明水溶性O-羥乙基殼聚糖衍生物納米顆粒具有良好的生物相容性和抗癌選擇性；通過對正常肝細胞L02活力的檢測發現，殼聚糖納米顆粒無細胞毒性，而對于癌細胞如MCF-7、H印G2、SH-SY5Y均有一定的毒性。
[0047]4、本發明制得的水溶性O-羥乙基殼聚糖衍生物納米顆粒可作為一種安全而有效的藥物載體，可以增加藥物的溶解度，通過緩釋、控釋的形式增長藥物的作用時間，從而提高藥物的生物利用度。
【附圖說明】
[0048]圖1為本發明水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒的制備反應方程式流程圖。
[0049]圖2為本發明水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒與殼聚糖的紅外光譜(IR)圖。
[0050]圖3為本發明水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒與殼聚糖的1H-NMR譜圖。
[0051]圖4為本發明水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒的透射電鏡圖。
[0052]圖5為本發明實施例1中殼聚糖衍生物納米顆粒(CS-g-TPS)與水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒(CS-g-TPS-OH)的粒徑分布。
[0053]圖6為本發明水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒的UV圖。
[0054]圖7為本發明水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒對L02細胞毒性的影響。
[0055]圖8為本發明水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒對MCF-7細胞毒性的影響。
[0056]圖9為本發明水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒對SH-SY5Y細胞毒性的影響。
[0057]圖10為本發明水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒對IfepG2細胞毒性的影響。
【具體實施方式】
[0058]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0059]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0060]實施例1、水溶性O-羥乙基殼聚糖納米顆粒的制備與應用試驗
[0061]一、制備
[0062]按照如圖1所示的反應方程式進行制備水溶性O-羥乙基殼聚糖。
[0063](I)水溶性O-羥乙基殼聚糖的制備方法
[0064]取1.5g殼聚糖(簡稱CS)，溶于150ml、體積分數為8%的乙酸水溶液，攪拌至完全溶解，殼聚糖乙酸水溶液轉移至三口燒瓶；加入高硼酸鈉0.12g，控溫60°C，高速攪拌，反應5h后，加氫氧化鈉溶液調整反應體系pH值至10?12，控溫4?5°C，將1ml環氧乙燒分多次加入反應體系，以8?15°C /h速率升溫至60°C，繼續控溫60°C，1200?1500r/min攪拌，反應3d，得20?40nm的高水溶性O-羥乙基殼聚糖水溶液。
[0065](2)水溶性殼聚糖衍生物(CS-g-TPS)納米顆粒的制備方法
[0066]取20ml上述制備的水溶性O-羥乙基殼聚糖溶液(與TPS的質量比是10