一種肺炎鏈球菌莢膜多糖的純化方法【
技術領域：
】[0001]本發明的領域涉及一種肺炎鏈球菌莢膜多糖的純化方法，尤其涉及一種簡化的純化方法。【
背景技術：
】[0002]肺炎鏈球菌是呼吸道感染的首要致病菌，既是引起兒童社區獲得性肺炎最常見的病原菌，也是致使老年人致命性肺炎感染的主要病原菌。目前發現90余個血清型，其中約30個血清型的菌株對人類有致病性。莢膜多糖是肺炎鏈球菌的主要毒力因子，研究結果表明肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗具有良好的免疫原性和安全性。[0003]制備肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗一般過程為：細菌在發酵罐中生長，在發酵結束時通過加入脫氧膽酸鈉或者另外的裂解劑誘導裂解。然后收獲裂解物以進行下游的純化并回收圍繞細菌細胞的莢膜多糖。所述多糖包含于最終的疫苗產物中，并賦予疫苗靶向群體對于選定的肺炎鏈球菌血清型的免疫力。[0004]在發酵培養過程中，除了產生莢膜多糖之外，還產生大量的蛋白質、核酸等成分，當疫苗中含有這些成分且含量超過一定標準時，接種后可能導致較嚴重的副反應。《歐洲藥典》肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗規程對莢膜多糖中的蛋白質含量、核酸含量和特異多糖含量有嚴格的要求。[0005]肺炎鏈球菌莢膜多糖的純化方法已有諸多報道和研究，但仍存在一些不足。例如，EP8026320中描述了一種經典的肺炎鏈球菌莢膜多糖純化方法，即肺炎鏈球菌發酵培養液經脫氧膽酸鈉裂解后，離心超濾濃縮，用乙醇進行兩步分級沉淀，再用苯酚抽提法去除蛋白質，用活性炭吸附法去除核酸。該方法步驟繁瑣，耗時較多，所用試劑中含有有毒的苯酚，對人體及環境均有危害。另外，乙醇的使用在操作和試劑保存方面均存在重大安全隱患。[0006]US4242501、US4686102將此方法進行了改進，用溴化十六烷基三甲銨(CTAB)替代了苯酚，但仍然沒有避免乙醇的使用。US20100129881和NormaSuarez等人（NORMASUA，REZ,LAURAFRANCO,etal.，FRAGUASAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,2001，p.969-971Vol.67,No.2)，在肺炎鏈球菌莢膜多糖純化工藝中引入了柱層析的方法，但該方法對操作人員的要求較高，樣品處理時間較長，且設備的運行及維護費用高昂，很難滿足大規模生產的需求。CA1206905提出了酶解法純化肺炎鏈球菌莢膜多糖，VivianeMaimoniGOftQalveS(VivianeMaimoniGor^alves,etal.,Simpleandefficientmethodofbacterialpolysaccharidespurificationforvaccinesproductionusinghydrolyticenzymesandtangentialflowultrafiltration,CommunicatingCurrentResearchandEducationalTopicsandTrendsinAppliedMicrobiology,2007,1(13):450-457；VivianeMaimoniGongaives；etal.,PurificationofCapsularpolysaccharidesformstreptococcuspneumoniaeserotype23Fbyaproceduresuitableforscale-up,Biotechnol.Appl.Biochem.，2003,37(3):283-287)等人，又做了一些改進，但這些方法均需使用多種核酸酶、蛋白酶，步驟較多，成本較高，而且仍需乙醇分級沉淀處理，存在安全隱患。【
發明內容】[0007]本發明針對以上問題，提供了一種更為簡單，成本更低的純化方法。[0008]本發明的在于提供一種肺炎鏈球菌莢膜多糖的純化方法，其含有以下步驟：[0009](a)細胞裂解[0010]提供包含可產生選定肺炎鏈球菌血清型的細菌細胞的發酵培養液；[0011]加入脫氧膽酸鈉溶解所述步驟中的細菌細胞，由此產生包含細胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細胞溶解產物；使用離心處理細胞溶解產物，取上清；[0012]對上清液進行超濾濃縮，以去除低分子量雜質并濃縮，由此產生第一澄清細胞溶解產物；[0013](b)脫氧膽酸鈉處理[0014]在步驟（a)第一澄清細胞溶解產物中加入脫氧膽酸鈉，并將pH降低至4-5以使蛋白質和/或核酸沉淀，離心處理取上清液，得到酸化溶解產物；[0015]重復1-2次，獲得進一步純化的酸化溶解產物；[0016]對進一步純化的的酸化溶解產物進行超濾濃縮，以去除低分子量雜質并濃縮，以獲得第二澄清細胞溶解產物；[0017](c)核酸酶處理[0018]使用核酸酶處理所述步驟（b)中的第二澄清細胞溶解產物；[0019]在核酸酶處理的細胞溶解產物中加入脫氧膽酸鈉，并將pH降低至4-5以使蛋白質和/或核酸沉淀，離心處理取上清液；[0020]對上清液進行超濾濃縮，以去除低分子量雜質并濃縮，從而獲得純化多糖溶液。[0021]其中，前述純化多糖溶液可通過干燥步驟進行干燥，所述的干燥步驟可為包括噴霧干燥、流化床（fluidizedbed)干燥、轉鼓式干燥、真空冷凍干燥在內的常見干燥方式，但是出于便捷、以及純化多糖溶液的穩定性考慮，優選地采取真空冷凍干燥。[0022]其中，前述步驟（a)，（b)，（c)中的超濾濃縮是指用截留分子量為100Kd_300Kd的超濾膜超濾濃縮。[0023]其中，前述步驟（a)中的脫氧膽酸鈉為終濃度為0.05-0.2%的脫氧膽酸鈉，前述步驟（b)，（c)中的脫氧膽酸鈉為終濃度為0.2-3%的脫氧膽酸鈉。需要說明的是，由于在步驟（b)中，脫氧膽酸鈉的添加量可能分多次重復加入，而此處說明的終濃度含量，是在多次重復添加后的最終濃度含量，且該濃度百分比為質量百分比。[0024]其中，前述步驟（a)中的脫氧膽酸鈉的處理時間為12-15小時，溫度為18~22°C;所述步驟（b)，（c)中的脫氧膽酸鈉處理時間為8-15分鐘，溫度為18~22°C。[0025]其中，前述步驟（a),(b)，（c)中的離心過程中的離心力為6000g，離心時間為15~35分鐘。[0026]其中，步驟（c)中的核酸酶為脫氧核糖核酸酶I(Sigma公司，貨號：DN25,批號：SLBC4924V)〇[0027]其中，步驟（c)中的核酸酶處理還混合有CaCl2,MgCl2。[0028]其中，步驟（c)中的核酸酶處理時間為3-8小時，溫度為35_37°C。[0029]本方法的優勢為：1.避免苯酚的使用，產品更安全環保；2.無乙醇的純化工藝，消除了安全隱患；3.只使用一次核酸酶，縮短了工藝時間，降低了生產成本；4.工藝操作簡便，可實現大規模放大。[0030]下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料或生物制劑，如無特殊說明，均為可從市場上購得的常規試劑。以下實施例中的定量實驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。【具體實施方式】[0031]實施例1:1型肺炎鏈球菌莢膜多糖的純化[0032]1型肺炎球菌發酵培養液5L，加入脫氧膽酸鈉，使其終濃度為0.15%，置于室溫下裂解12小時。隨后將裂解液離心（離心力：6000g，離心時間：35分鐘），收取上清液。隨后將該上清液通過l〇〇Kd膜包超濾濃縮至1000ml。加入脫氧膽酸鈉，使其終濃度為0.5%，調口11至4.4，室溫靜置10分鐘，進行離心（離心力：600(^，離心時間：15分鐘），收集上清液。隨后重復前述步驟，再加入0.5%脫氧膽酸鈉，調pH至4.4,室溫靜置10分鐘，進行離心（離心力：6000g，離心時間：15分鐘），收集上清液。隨后將該上清液通過300Kd膜包超濾透析。具體透析液為〇.〇5mol/LpH7.OTris-HCl緩沖液，收透析液1000ml。隨后將透析過的處理液通過核酸酶進行處理，具體方式為：加入CaCl2(終濃度lmmol/L)、MgCl2(終濃度10mm〇l/L)，混勻后加入核酸酶50mg，35-37°C酶解8小時。隨后，加入0.5%脫氧膽酸鈉，調pH至4.3,并離心（離心力：6000g，離心時間：15分鐘），收集上清液。最后將獲得上清液通過300Kd膜包超濾濃縮至950ml，并最后將該濃縮產物冷凍干燥。純化后的肺炎鏈球菌莢膜多糖具體標準效果如表1所示：[0033]表11型肺炎鏈球菌純化莢膜多糖各項檢測結果（其中，表1第一列中的參數為《歐洲藥典》中的含量限定值，下同）[0034][0035]實施例2:3型肺炎鏈球菌莢膜多糖的純化[0036]3型肺炎鏈球菌發酵培養液1L，加入脫氧膽酸鈉，使其終濃度為0.05%，置于室溫下裂解15小時。隨后對裂解液進行離心（離心力：6000g，離心時間：35分鐘），收取上清液。隨后將該上清液通過l〇〇Kd膜包超濾濃縮至1000ml。加入脫氧膽酸鈉，使其終濃度為1%，調pH至4.0,室溫靜置10分鐘，進行離心（離心力：6000g，離心時間：15分鐘），收集上清液。隨后重復前述步驟，再加入1%脫氧膽酸鈉，調pH至4.0,室溫靜置10分鐘，離心(離心力：6000g，離心時間：15分鐘），收集上清液。當前第1頁1 2 3 4