一種檢測丹參酮iia的方法及其專用酶聯免疫試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測丹參酮IIA的方法及其專用酶聯免疫試劑盒，屬于生物技術 領域。
【背景技術】
[0002] 丹參為臨床常用中藥，具有活血祛瘀，調經止痛，清熱安神，涼血消癰等功效。丹參 中的丹參酮類化合物表現出多種藥理活性，對心腦血管疾病、肝炎、白血病等具有潛在的治 療作用。丹參酮IIA是其主要丹參酮類成分，2010版《中國藥典》以丹參酮IIA作為丹參質 量控制指標性成分之一。
[0003]目前，丹參酮IIA檢測方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、液質聯用技術、近紅 外光譜檢測等技術，但上述方法均無法同時滿足簡單快速、高通量、現場檢測的需求。酶聯 免疫吸附檢測法具有操作簡便、靈敏度高、通量高、檢測快速、成本低廉等特點，在中藥材的 品質鑒定方面應用廣泛。丹參市場需求量大，但市售丹參藥材質量參差不齊，嚴重影響丹參 藥用療效及其他復方產品開發應用，所以建立一種簡便、快速、高通量的丹參酮IIA的檢測 方法對丹參的質量控制具有非常重要的意義。
【發明內容】
[0004]本發明的第一個目的是提供抗丹參酮IIA的單克隆抗體，
[0005]本發明提供的抗丹參酮IIA的單克隆抗體由保藏號為CGMCCNo. 10879的雜交瘤 細胞株分泌的。
[0006]本發明的第二個目的是提供一株分泌抗丹參酮IIA的單克隆抗體的雜交瘤細胞 株DST2H4。
[0007]本發明提供的分泌抗丹參酮IIA的單克隆抗體的雜交瘤細胞株DST2H4的保藏號 為CGMCCNo. 10879。
[0008]本發明保護保藏號為CGMCCNo. 10879的雜交瘤細胞株DST2H4,該雜交瘤細胞株 的分類命名為小鼠雜交瘤細胞系，該雜交瘤細胞株已于2015年6月2日保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3 號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)。
[0009]本發明的第三個目的是提供上述單克隆抗體或上述雜交瘤細胞株DST2H4的新 用途。
[0010] 本發明提供了上述單克隆抗體或上述雜交瘤細胞株DST2H4在檢測或輔助檢測 待測樣品中丹參酮IIA含量中的應用。
[0011] 本發明還提供了上述單克隆抗體或上述雜交瘤細胞株DST2H4在比較或輔助比 較待測樣品中丹參酮IIA含量高低中的應用。
[0012] 本發明還提供了上述單克隆抗體或上述雜交瘤細胞株DST2H4在制備檢測或輔 助檢測待測樣品中丹參酮IIA含量的試劑或試劑盒中的應用。
[0013] 本發明還提供了上述單克隆抗體或上述雜交瘤細胞株DST2H4在制備檢測或輔 助檢測待測樣品中丹參酮IIA含量的膠體金試紙條中的應用。
[0014] 本發明的第四個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測樣品中丹參酮IIA含量的 酶聯免疫試劑盒。
[0015] 本發明提供的檢測或輔助檢測待測樣品中丹參酮IIA含量的酶聯免疫試劑盒包 括獨立包裝的上述單克隆抗體。
[0016] 本發明提供的檢測或輔助檢測待測樣品中丹參酮IIA含量的酶聯免疫試劑盒還 可含有分別為獨立包裝的丹參酮IIA標準品和/或用于標記所述單克隆抗體的標記酶；
[0017] 所述丹參酮IIA標準品可為丹參酮IIA或由所述丹參酮IIA配制成的一系列不 同濃度的丹參酮IIA溶液；所述一系列不同濃度的丹參酮IIA溶液的濃度具體可為：40ng/ mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、1. 25ng/mL和 0? 625ng/mL;所述丹參酬IIA溶液的 溶劑具體可為PBS緩沖液；所述PBS緩沖液的溶劑為水，溶質為Na2HP04、KH2P〇dPNaCl，溶 質Na2HP04、KH2P〇dPNaCl在所述PBS緩沖液中的濃度分別為0. 02M、0. 0015M和0. 14M，pH 值為7. 5;
[0018] 所述標記酶具體可為辣根過氧化物酶。
[0019] 本發明提供的檢測或輔助檢測待測樣品中丹參酮IIA含量的酶聯免疫試劑盒還 可含有分別為獨立包裝的包被緩沖液和/或洗滌液和/或底物緩沖液和/或終止緩沖液和 /或封閉液；
[0020] 所述包被緩沖液的溶劑為水，溶質為Na2C0jPNaHCO3;溶質Na20)3和NaHCO3在所 述包被緩沖液中的濃度分別為〇. 01M和0. 04M;所述包被緩沖液的pH值為9. 6 ;
[0021] 所述洗滌液的溶劑為水，溶質為Na2HP04、KH2P04、NaCl和吐溫-20 ;溶質Na2HP04、 KH2P04、NaCl和吐溫-20在所述洗滌液中的濃度分別為0. 02M、0. 0015M、0. 14M和0. 1% (體 積百分含量）；所述洗滌液的pH值為7. 5 ;
[0022] 所述底物緩沖液的溶劑為水，溶質為檸檬酸三鈉和Na2HP04;溶質檸檬酸三鈉和 Na2HP04在所述底物緩沖液中的濃度分別為0. 01M和0. 03M;所述底物緩沖液的pH值為 5. 5；
[0023] 所述終止緩沖液為2M的硫酸水溶液；
[0024] 所述封閉液的溶劑為水，溶質為Na2HP04、KH2P04、NaCl和脫脂牛奶；溶質Na2HP04、 KH2P04、NaCl和脫脂牛奶在所述封閉液中的濃度分別為0. 02M、0. 0015M、0. 14M和3% (質量 百分含量）；所述封閉液的pH值為7. 5。
[0025] 上述酶聯免疫試劑盒中，所述樣品為丹參。
[0026] 上述酶聯免疫試劑盒在檢測或輔助檢測待測樣品中丹參酮IIA含量中的應用也 屬于本發明的保護范圍。
[0027] 上述應用中，所述樣品為丹參。
[0028] 本發明提供了一種檢測丹參酮IIA的方法及其專用酶聯免疫試劑盒。本發明所提 供的酶聯免疫試劑盒包括抗丹參酮IIA單克隆抗體，該單克隆抗體是通過間接競爭ELISA 方法篩選出的雜交瘤細胞株CGMCCNo. 10879分泌的。通過實驗證明：本發明所提供抗丹參 酮IIA的單克隆抗體特異性強，對隱丹參酮的交叉反應率為28. 321%;對丹參酮I的交叉 反應率為10. 088%;對二氫丹參酮的交叉反應率為3. 105%;對丹酸酸B、丹參素和迷迭香 酸的交叉反應率均小于0. 001% ;利用該單克隆抗體制備得到的間接競爭酶聯免疫試劑盒 可用于定性或定量檢測待測樣品中的丹參酮IIA，線性檢測范圍在1. 01~20. 89ng/mL，具 有快速、靈敏的優點。
【附圖說明】
[0029] 圖1為丹參酮IIA和丹參酮IIB的化學結構。
[0030] 圖2為丹參酮IIA完全抗原制備路線圖。
[0031] 圖3為酶聯免疫試劑盒檢測丹參酮IIA濃度的標準曲線。
[0032] 圖4為ELISA檢測樣品中丹參酮IIA含量結果與HPLC檢測結果相關性曲線圖。
【具體實施方式】
[0033] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0034] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0035] 弗氏完全佐劑：Sigma公司，產品目錄編號為F5881。
[0036] 弗氏不完全佐劑：Sigma公司，產品目錄編號為F5506。
[0037] 丹參酮IIA標準品溶液：將丹參酮IIA溶于PBS緩沖液后得到的溶液。
[0038] PBS緩沖液：溶劑為水，溶質為Na2HP04、KH2P0#NaCl，溶質Na2HP04、KH2P0#NaCl 在PBS緩沖液中的濃度分別為0. 02M、0. 0015M和0. 14M;pH值為7. 5。
[0039] 包被緩沖液：溶劑為水，溶質為Na2C0jPNaHCO3;溶質Na20)3和NaHCO3在包被緩沖 液中的濃度分別為0. 01M和0. 04M;pH值為9. 6。
[0040] 洗滌液：溶劑為水，溶質為Na2HP04、KH2P04、NaCl和吐溫-2