四溴雙酚a人工免疫原tbbpa-bsa的制備及用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種四溴雙酚A人工免疫原TBBPA-BSA的制備方法及用途，具體是 一種用于有機污染物四溴雙酚A免疫檢測的溴代阻燃劑一一四溴雙酚A的人工免疫原 TBBPA-BSA的制備方法及用途。
【背景技術】
[0002] 溴代阻燃劑（BrominatedFlameRetardant，BFRs)是指能使聚合物不容易著火或 者著火后使其燃燒變慢的一種助劑。溴代阻燃劑是目前世界上產量和用量最大的有機阻燃 劑之一。其中，四溴雙酚A(簡稱TBBA或TBBPA或TBA)是目前我國有機溴代阻燃劑主要產 品，也是世界上用量第二大的溴代阻燃劑，它主要是由雙酚A溴化所得。全球四溴雙酚A的 產量從1994年的0. 64萬噸增加到2012年的2萬噸，并在電子產品、紡織品、建筑裝潢材料 等各種制造業產品和材料中廣泛使用；此外，隨著這些產品的使用，TBBPA可以慢慢逸散到 環境中。
[0003]國內外廣大環境學者對各種環境介質和生物樣品中TBBPA的濃度和毒性效應 做了大量研究。研究表明，TBBPA可以在各種水體、底泥、土壤、大氣等各種環境介質中存 在，并可以隨氣溶膠遠距離迀移。在不同營養級生物體內含量變化表現出明顯的生物富 集性，并對生物體有毒性和內分泌干擾性。TBBPA的污染能力有很高的持久性，主要危害 有三點：首先，長期接觸會妨礙大腦和骨骼發育；其次，被焚化處理時，會釋放出有高致癌 性的溴化二惡英和呋喃。因此，研究認為TBBPA是潛在的具有持久性、生物累積性和毒性 (PBT-persistent bioaccumulative toxie)的化合物。早在2003年，TBBPA就已經引起世 界綠色和平組織的重視。歐盟關于環保的"2個指令"起初計劃限制所有溴代阻燃劑的使 用，并設想以磷、氮替代，但因氮、磷資源缺乏，個別性能遠不能滿足需求以及可能造成水體 的富營養化的潛在風險，而未將TBBPA納入。目前，TBBPA已作為危害物質被列入《東北大 西洋海洋環境保護條例》0SPAR的名錄中。
[0004]目前，關于TBBPA的研究主要集中在水體、沉積物、大氣等環境領域和生物體的毒 性方面，但樣品的檢測方法方面研究較少。目前對四溴雙酚A的檢測手段主要為氣相色譜 和高效液相色譜等儀器檢測方法，這些方法雖然準確可靠，但對樣品的預處理方法和操作 人員的專業性有很高的要求。正因為這些方法的處理復雜、耗時、儀器價格昂貴而不適合推 廣使用，也不利于在環境污染事故現場快速檢測。為克服這些缺點，尋求一種快速、簡便、靈 敏且經濟實用的分析方法就成為環境監測領域的主要研究方向。因此，開展研究并建立有 效、可靠的含溴阻燃劑的檢測方法及標準，并通過相關的法規予以保障，成為一項極為重要 和迫切的工作。
[0005] 20世紀60年代發展起來的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗體的特異 性、可逆性結合反應的分析技術。免疫分析具有常規理化分析技術無可比擬的選擇性和高 靈敏性，非常適合復雜介質中痕量組分的分析。因此免疫分析具有的特異性強、靈敏度高、 方法快捷簡單、分析通量大、檢測成本低等優點，使得該類方法可以滿足簡單、快速、靈敏地 檢測持久性有機污染物的要求。1985年美國Cetus公司的K.B.Mullis和R.K.Saiki等發 明了一種特異性DNA體外擴增技術，成為PolymeraseChainReaction，簡稱PCR，即聚合酶 鏈式反應。1992年Sano等將免疫分析技術與PCR技術結合，發展出熒光免疫PCR技術。熒 光免疫PCR技術兼具了免疫分析的特異性強和PCR技術的靈敏度高（檢測限高達10 11~ 10 12g/L)的特點，可用于檢測環境中痕量污染物。
[0006] 目前，尚無用熒光免疫PCR技術檢測TBBPA的相關報道。而制備合格的TBBPA抗 原是生物免疫得到高特異性抗TBBPA抗體的前提，更是建立TBBPA免疫檢測分析方法的關 鍵，這將具有重要的應用價值和理論研究意義。
【發明內容】
[0007] 針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是首次提供一種步驟簡單，速度快，產率高 的四溴雙酚A人工免疫原TBBPA-BSA制備方法，為免疫得到特異性抗體和利用人工抗原、抗 體建立免疫檢測方法奠定基礎。
[0008] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0009] 本發明提供了 一種四溴雙酚A人工免疫原TBBPA-BSA，結構如式I所示：
[0010]
[0011] 其中BSA為牛血清蛋白。
[0012] 本發明還提供了一種四溴雙酚A人工免疫原TBBPA-BSA的制備方法，包括以下步 驟：
[0013]TBBPA半抗JI
與載體蛋白BSA偶聯制備TBBPA-BSA。
[0014] 優選地，所述TBBPA半抗原通過TBBPA與溴乙酸在堿性環境中反應制備得到。所 述TBBPA半抗原化學名稱為3_(2, 6_二漠_4-(2-(3, 5_二漠_4_輕苯基）丙烷_2_基）） 丙酸，分子量為601. 92。
[0015] 優選地，所述TBBPA半抗原的制備包括以下步驟：
[0016] A1、將TBBPA和堿金屬氫氧化物溶解在非質子性有機溶劑中，得溶液A，逐漸升溫；
[0017]A2、將溶解于非質子性有機溶劑的溴乙酸逐滴加入到步驟A1中升溫后的溶液A 中，隨后保持恒溫回流反應，直至原料點消失為止。
[0018] 優選地，所述的TBBPA、堿金屬氫氧化物和溴乙酸的摩爾比為1:2~4:1~2 ;所述 步驟A2中溶液A的溫度為80~85°C，恒溫回流反應時間為4~6小時。
[0019] 優選地，所述反應時間為4~6小時，反應溫度為80~85°C。
[0020] 優選地，所述TBBPA半抗原與載體蛋白BSA偶聯制備TBBPA-BSA的方法包括以下 步驟：
[0021] B、將溶有N-羥基琥珀酰亞胺和N，N' -二環己基碳酰亞胺的有機溶劑A逐滴加入 溶有TBBPA半抗原的有機溶劑B中，攪拌反應，過夜，離心分離上清液；
[0022] C、將上清液加入到溶有牛血清蛋白BSA的磷酸鹽緩沖液中反應；
[0023] D、反應結束后，將溶液裝入透析袋透析；透析后離心分離上清液，即得TBBPA人工 免疫原TBBPA-BSA。
[0024] 本發明采用活化酯法合成四溴雙酚A人工免疫原，其反應方程式如下：
[0025]
[0026] 優選地，所述的有機溶劑A和B獨立的選自非質子性有機溶劑，具體包括N，N' -二 甲基甲酰胺或二甲基亞砜。
[0027] 優選地，所述的TBBPA半抗原、N-羥基琥珀酰亞胺、N，N' -二環己基碳酰亞胺、BSA 摩爾比為1:1~3:1~3:0. 005~0. 05。經過碳二亞胺縮合反應，蛋白質分子中的游離羧 基能與半抗原分子中的氨基形成較為穩定的酰胺鍵，該反應條件比較溫和，應用范圍廣。理 想狀態下，半抗原與N-羥基琥珀酰亞胺、N，N' -二環己基碳酰亞胺反應的摩爾比是1:1: 1， 為了充分快速反應，最多將摩爾比例調為1:3:3。
[0028] 優選地，所述步驟B中攪拌反應時間為6~12小時。為充分反應，當半抗原與N-羥 基琥珀酰亞胺、N，N'-二環己基碳酰亞胺反應的摩爾比是1:3:3時攪拌反應6小時就可以， 當半抗原與N-羥基琥珀酰亞胺、N，N'-二環己基碳酰亞胺反應的摩爾比是1:1:1時且攪拌 速度稍慢的時候需反應12小時。
[0029] 優選地，所述步驟C的反應時間為2~6小時，反應溫度為0~4°C。當蛋白較少 時2小時就可以，當蛋白量加入較多的時候就反應6小時才能反應完全。該反應為低溫反 應，蛋白質最適宜保存溫度是〇~4度。0度以下結冰無法反應；溫度過高，則將導致蛋白 質失效。
[0030] 全抗原的表征：
[0031] 將制備的全抗原適當稀釋，使其吸光度在0. 1-2之間，以PBS為空白對照，用紫外 分光光度計在200~500nm分別測定TBBPA半抗原和TPPBA-BSA吸光值，繪制紫外吸收光 譜圖，并根據以下公式計算偶聯比：
[0032]
[0033]式中：〇DCC]_gate偶聯物吸光度；〇Dprotein蛋白質吸光值；〇Dhapten半 抗原吸光值；Chapten--半抗原濃度；