一種十三肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制藥領域，具體涉及一種合成多肽及其應用。
【背景技術】
[0002] 生物活性肽是對機體的功能或狀態具有積極作用并最終影響機體健康的特殊蛋 白質片段。相較于蛋白質而言，小分子肽片段的優越性主要體現在：更易被人體吸收利用； 活性高，在較小濃度下即可發揮其特有的生理作用；分子量小，易于修飾和改造，能夠通過 人工化學合成等。而相較于單一的氨基酸而言，小分子肽除了具有特殊的生理活性外，在 吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸無可比擬的優越性。已有研究證實，人體小腸存在專 門的低聚肽吸收通道，人體攝入的蛋白質經過多種消化酶的水解，主要以低肽的形式被吸 收。許多研究表明，各種來源的生物活性肽具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降壓、降血糖等多種 作用，成為生物醫藥和保健品開發的熱點。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種具有體外抗腫瘤活性的合成多肽即合成十三肽，可應用 于生物制藥領域。本發明選取五種腫瘤細胞此?-7、11印6-2、36(：-7901、4549和111'-29以及 一種正常肝細胞L-〇2為研究對象，使用MTT法測定合成肽的體外抑制活性。
[0004] 本發明所述的合成多肽縮寫為YGFVMPRSGLWFR，分子量1614. 9,序列為：Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg。其中， Tyr表示英文名稱為Tyrosine，中文名稱為酪氨酸的氨基酸的相應殘基； Gly表示英文名稱為Glycine，中文名稱為甘氨酸的氨基酸的相應殘基； Phe表示英文名稱為phenylalanine，中文名稱為苯丙氨酸的氨基酸的相應殘基； Val表示英文名稱為Valine，中文名稱為纈氨酸的氨基酸的相應殘基； Met表示英文名稱為Methionine，中文名稱為甲硫氨酸的氨基酸的相應殘基； Pro表示英文名稱為proline，中文名稱為脯氨酸的氨基酸的相應殘基； Arg表示英文名稱為arginine，中文名稱為精氨酸的氨基酸的相應殘基； Ser表示英文名稱為serine，中文名稱為絲氨酸的氨基酸的相應殘基； Gly表示英文名稱為Glycine，中文名稱為甘氨酸的氨基酸的相應殘基； Leu表示英文名稱為Leucine，中文名稱為亮氨酸的氨基酸的相應殘基； Trp表示英文名稱為Tryptophan，中文名稱為色氨酸的氨基酸的相應殘基； Phe表示英文名稱為phenylalanine，中文名稱為苯丙氨酸的氨基酸的相應殘基； Arg表示英文名稱為arginine，中文名稱為精氨酸的氨基酸的相應殘基。
[0005] 本發明所述的氨基酸序列采用標準Fmoc方案，通過樹脂的篩選，合理的多肽合 成方法。將目標多肽的C-端羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這 個氨基酸的氨基作為起點，與另一分子氨基酸的羧基作用形成肽鍵。不斷重復這一過程，即 可以得到目標多肽產物。合成反應完成后，去除保護基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標產 物。多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，固相合成順序從C端向N端合成。
[0006] 本發明將終濃度為30-500Pg/mL的合成多肽與五種腫瘤細胞MCF-7、H印G-2、 SGC-7901、A549和HT-29混勻，孵育48h后，經MTT法檢測，對腫瘤細胞抑制率達到 46. 68%~76. 06%。用500Pg/mL的合成多肽處理正常肝細胞后，其L-〇2增殖9%，表明對正 常肝細胞L-〇2無殺傷作用，反而有一定的促進增殖的效果，安全性非常好，為其在生物醫 藥領域的應用提供參考。
[0007] 更具體的，將終濃度為30-500Pg/mL的所述十三肽與腫瘤細胞IfepG-2、 SGC-7901、A549 和HT-29 混，孵育 48h后，對四種腫瘤細胞IfepG-2、SGC-7901、A549 和HT-29 的抑制率分別為 17. 57%-71. 79%、20. 75%-51. 55%、22. 17%-76. 06%和 3. 22%-57. 27%。將濃度 為500l^g/mL的所述十三肽與五種腫瘤細胞MCF-7、H印G-2、SGC-7901、A549和HT-29混，孵 育48h后，對A549和H印G-2的體外增殖抑制作用最強，抑制率分別為76. 06%和71. 79% ;其 次為HT-29、SGC-7901和MCF-7,其抑制率分別為57. 27%、51. 55%和46. 68%。所述十三肽對 A549、H印G-2、SGC-7901 和HT-29 的半數抑制濃度IC50 值分別為 104. 05Pg/mL、188. 23噸/ mL、247. 32Pg/mL和 446. 72Pg/mL。
[0008] 與現有技術相比，本發明具有如下優點和技術效果： 本發明首次合成了該肽，并且采用MTT方法檢測了合成多肽的體外抗腫瘤活性，所述 合成多肽具有很強的腫瘤細胞抑制能力，同時，合成多肽對正常肝細胞無殺傷作用。
【附圖說明】
[0009] 圖la為合成多肽Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg的 HPLC圖。
[0010] 圖lb為合成多肽Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg的 ESI-MS圖，其中橫坐標為m/z(質荷比值）、縱坐標為relativeabundance(相對強度）。
[0011] 圖 2 為合成肽Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg對 MCF-7、IfepG-2、SGC-7901、A549、HT-29 和L-02 的體外抑制作用（500Pg/mL)。
【具體實施方式】
[0012] 以下結合具體實例對本發明作進一步說明，但本發明的實施和保護范圍不限于 此。對于未特別注明的工藝參數，可參照常規技術進行。
[0013] 多肽固相合成 選用高分子樹脂（中肽生化有限公司），按照氨基酸序列Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Ar g-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg的特征，先將Arg的羧基以共價鍵的形式與一個樹脂相連，然 后Arg的氨基和Phe的羧基縮水反應，處理后，再添加Trp，Phe的氨基和Trp的羧基反應， 依次從右到左添加氨基酸，加好最后一個Tyr氨基酸后，再切除樹脂即得到目標多肽。采 用高效液相色譜進行純化，色譜柱型號為PhenomenexC1S，尺寸4.6*150mm，流動相A:含有 0. 1%三氟乙酸（TFA)的水；流動相B:含有0.09%TFA的溶液（80%乙腈+20%水）；20min 內B相由14.0%上升到24.0%，流速1. 0mL/min，檢測波長220nm。液氮速凍，冷凍干燥，得 到最后的產品，要求純度達到96.3%以上，并經ESI-MS鑒定結構。圖la為合成多肽Tyr-G ly-Phe-Val-Met-Pr〇-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe -Arg的HPLC圖。圖lb為合成多肽yr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg的ESI-MS圖，其中橫坐標為m/z(質荷比值）、縱坐標為relative abundance(相對強度）。
[0014] 合成多肽的體外抗腫瘤活性 通過MTT比色法分析各多肽組分對肝癌細胞IfepG-2、乳腺癌細胞MCF-7、胃癌細胞SGC-7901、肺癌細胞A549和結腸癌細胞HT-29的生長抑制作用。具體操作步驟如下： 1) 取對數生長期的細胞，經0. 25%(體積)的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相應的 完全培養基終止消化并重懸細胞，血球平板計數后，調整細胞懸液的濃度至5X104個/mL， 加至96孔板中，每孔100ML,于