一種六肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物制藥與化妝品等領域，具體涉及一種合成六肽及其應用。
【背景技術】
[0002] 生物活性肽具有多種人體代謝和生理調節功能，易消化吸收，有促進免疫調節、抗 菌、降血壓、抗癌、抗氧化等作用，從二肽到復雜的線性、環形結構的不同肽類，由25個天然 氨基酸通過肽鍵以不同組成和排列方式構成。活性肽安全性極高，是當前國際食品界最熱 門的研究課題和極具發展前景的功能因子。現代營養學表明，蛋白質經消化道酶作用后并 不完全以游離氨基酸的形式吸收，大多以低肽的形式吸收，并且低肽比游離氨基酸具有更 高的營養價值和生物效價。
[0003] 自二十世紀中葉以來，隨著人們生活水平的提高以及細胞生物學、分子生物學等 學科的飛速發展，科學家們對于衰老機制的探索取得了長足的進步，其中廣泛研究的理論 有自由基-氧化應激學說，炎性學說，免疫學說，線粒體DNA學說等，其中，自由基-氧化應 激學說最受重視，并能與其他學說聯系起來，起到紐帶作用。該學說的發展始于Harman于 1956年提出，他認為自由基才是真正引發的機體老化的罪魁禍首，也是引起機體組織惡性 增生等各種惡性疾病的關鍵所在。1990年，美國Sohal教授發展了該學說，率先提出了氧化 應激的概念，并在自由基學說的基礎上發展形成了 "自由基-氧化應激學說"。具體而言， 正常的機體自身建立并形成一套完善的防御系統以規避自由基的損傷和破壞，如細胞內存 在的各種抗氧化物酶，如SuperoxideDismutase,SOD;GlutathionePeroxidase,GSH-Px 等，機體清除氧自由基的能力與其活性的高低直接相關。一旦機體因內因或外因導致自由 基增加過量從而無法及時清除時，由于自由基都帶有不成對的單電子，可以攻擊體內細胞， 會氧化生物膜不飽和脂肪酸、誘導蛋白質交聯變性、甚至損傷細胞核及線粒體DNA或RNA 等，從而損傷細胞和組織，最終導致機體功能的缺失和老化相關疾病的發生。因此，清除體 內過量的自由基在預防某些疾病的過程中具有重要作用。
[0004] 樣品清除自由基的能力是評價其抗氧化活性最常見的方法。ABTS，2, 2_聯氣-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽，是一種水溶性物質，可被Mn02氧化為比較穩定的 藍綠色ABTS自由基，此自由基在736nm有穩定的最大吸收峰，抗氧化劑能夠提供氫原 子將自由基還原為無色ABTS，可根據溶液在736nm處的吸光度變化來評估抗氧化劑清 除ABTS+的能力。DPPH(1，1_二苯基-2-苦肼基）是一種醇溶性物質，在醇溶液中生成以 氮原子為中心的穩定自由基、并呈深紫色，該自由基在522nm處有最大吸收峰，加入抗 氧化樣品后，溶液會褪色，可以通過其吸光值的變化來檢測樣品的抗氧化活性。FRAP方法 (FerricreducingantioxidantpotentialAssay)是測定物質抗氧化能力的一種方法。 原理是酸性條件下抗氧化物可以還原Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+_TPTZ)產生藍色 的Fe2+-TPTZ，隨后在596nm測定藍色的Fe2+-TPTZ即可獲得樣品中的總抗氧化能力。以 上三種模型由于操作簡便、快捷、可控性好，因此得到廣泛應用。
[0005] 構建細胞氧化損傷模型是評價樣品是否具有抗氧化能力的常用方法，而紅細胞由 于來源豐富、取材方便，是體外生物實驗中的常用材料。自由基首先攻擊紅細胞膜上的脂 質和蛋白質，使細胞膜破損，釋放出紅細胞中的血紅蛋白，稱為紅細胞溶血。AAPH、H202和 Hemin為常用的誘導紅細胞溶血的物質。樣品清除體系中存在的自由基從而抑制紅細胞溶 血。原子力顯微鏡（AFM)是一種高分辨率的新型成像工具，在生物醫學界已被廣泛用于細 胞形貌及其超微結構的表征，其原理是通過檢測探針掃描樣品時所產生的原子間相互作用 力來獲得樣品形貌結構信息，經計算機軟件處理成像。自由基攻擊細胞膜使之結構和功能 喪失，發生細胞溶血。這一結論通過用原子力顯微鏡（AFM)觀察對照組、損傷組和保護組紅 細胞形貌得到進一步驗證。
[0006] 皮膚老化主要是人的遺傳傾向性（也稱為年代老化）和人對環境應激的生理反應 (也稱為光老化）的結果。光老化是外界環境對皮膚的生物學應答的效果，是可被廣泛應 用的老化實驗模型。皮膚對光老化的應答通常與正常的水合作用的缺乏、皮膚下垂以及線 條和皺紋外觀有關。UVB照射可使成纖維細胞內活性氧（reactiveoxygenspecies，R0S) 堆積，超過了其清除能力，打破氧化與抗氧化平衡，發生氧化應激反應，調節一系列程序化 的細胞反應，甚至調控衰老相關的信號通路，促進細胞衰老的發生。有研究表明R0S在細胞 內的堆積是皮膚光老化發生發展過程中的重要環節。人皮膚成纖維細胞是人皮膚產膠原蛋 白的主要場所，其數量的多少和細胞膠原蛋白的產率與皮膚衰老狀態息息相關。因此，人皮 膚成纖維細胞的存活率和膠原蛋白的產率是被廣泛認可的評價皮膚衰老狀態的指標。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種具有體外抗氧化活性、保護紅細胞溶血以及促進人皮膚 成纖維細胞的增殖和膠原蛋白產生的合成六肽，可應用于生物制藥與化妝品等領域。
[0008] 本發明的合成六肽縮寫為GMCCSR，分子量654. 0，序列為： Gly-Met-Cys-Cys-Ser-Arg。其中， Gly表示英文名稱為Glycine，中文名稱為甘氨酸的氨基酸的相應殘基； Met表示英文名稱為Methionine，中文名稱為甲硫氨酸的氨基酸的相應殘基； Cys表示英文名稱為Cysteine，中文名稱為半胱氨酸的氨基酸的相應殘基； Ser表示英文名稱為Serine，中文名稱為絲氨酸的氨基酸的相應殘基； Arg表示英文名稱為Arginine，中文名稱為精氨酸的氨基酸的相應殘基。
[0009] 本發明所述的氨基酸序列采用標準Fmoc方案，通過樹脂的篩選，合理的多肽合 成方法。將目標多肽的C-端羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這 個氨基酸的氨基作為起點，與另一分子氨基酸的羧基作用形成肽鍵。不斷重復這一過程，即 可以得到目標多肽產物。合成反應完成后，去除保護基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標產 物。多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，固相合成順序從C端向N端合成。
[0010] 本發明將濃度為1-100Kg/mL的所述六肽與紅細胞混合，在終濃度為100mM的 AAPH的作用下，孵育2h后，使得紅細胞溶血率降低，其形貌比單純AAPH處理組光滑，有序， 呈現餅狀結構。所述細胞溶血抑制率達91. 80 ±1.34%。
[0011] 進一步地，所述六肽濃度為5呢/mL，所述六肽使紅細胞S0D活性由2. 5976 mgprot/mL上升到 6. 4819mgprot/mL〇
[0012] 進一步地，在UVB的作用下，將所述六肽與人皮膚成纖維細胞混合，孵育72h后， 使得細胞存活率提高7. 5%-19. 1% ;同時，膠原蛋白得率提高3. 27%-16. 53%，所述六肽的濃 度為 1-10Pg/mL。
[0013] 進一步實施地，本發明將所述合成六肽與正常人血紅細胞混勻，孵育，經AAPH損 傷2h后，使得細胞溶血抑制率達到91. 80 ±1.34%，用100噸/mL的合成六肽處理后的與 僅用AAPH損傷的紅細胞組相比，其形貌比單純AAPH處理組光滑，有序，呈現餅狀結構。用 5Pg/mL合成六肽處理后，細胞內S0D活力由2.5976mgprot/ml上升到6.4819mgprot/ ml，結果表明，合成六肽處理后紅細胞的SOD活性有較大提高，可在生物醫藥與化妝品制備 等領域應用。
[0014] 進一步實施地，本發明在UVB(80mJ/cm2)的作用下，將濃度為1-10 噸/mL的合成六 肽加入人皮膚成纖維細胞培養液中孵育，孵育72h后，使得細胞存活率提高7. 5%-19. 1% ; 同時，膠原蛋白得率提高3. 27%-16. 53%。膠原蛋白得率由模型組的11. 9512±1. 2067噸/ mL上升為合成六肽組的13. 9268 ±1.3409Pg/mL。
[0015] 與現有技術相比，本發明具有如下優