一種五肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物制藥與化妝品等領域，具體涉及一種五肽及其應用。
【背景技術】
[0002] 構建細胞氧化損傷模型是評價樣品是否具有抗氧化能力的常用方法，而紅細胞來 源豐富、取材方便，是體外生物實驗中的常用材料。自由基首先攻擊紅細胞膜上的脂質和蛋 白質，使細胞膜破損，釋放出紅細胞中的血紅蛋白，稱為紅細胞溶血。AAPH、H202和Hemin為 常用的誘導紅細胞溶血的物質。活性樣品的預處理，可以起到抑制紅細胞溶血的作用，從而 該模型通過測定紅細胞溶血抑制率和細胞內抗氧化酶S0D的活性來評價樣品的細胞內抗 氧化效果。原子力顯微鏡（AFM)是一種高分辨率的新型成像工具，在生物醫學界已被廣泛 用于細胞形貌及其超微結構的表征，其原理是通過檢測探針掃描樣品時所產生的原子間相 互作用力來獲得樣品形貌結構信息，經計算機軟件處理成像。自由基攻擊細胞膜使之結構 和功能喪失，發生細胞溶血。這一結論通過用原子力顯微鏡（AFM)觀察對照組、損傷組和保 護組紅細胞形貌得到進一步驗證。
[0003] 光老化是外界環境對皮膚的生物學應答的效果。皮膚對光老化的應答通常與正常 的水合作用的缺乏、皮膚下垂以及線條和皺紋外觀有關。UVB照射可使成纖維細胞內活性 氧（reactiveoxygenspecies，R0S)堆積，超過了其清除能力，打破氧化與抗氧化平衡，發 生氧化應激反應，調節一系列程序化的細胞反應，甚至調控衰老相關的信號通路，促進細胞 衰老的發生。大量研究表明R0S在細胞內的堆積是皮膚光老化發生發展過程中的重要環 節。人皮膚成纖維細胞是人皮膚產膠原蛋白的主要場所，其數量的多少和細胞膠原蛋白的 產率與皮膚衰老狀態息息相關。因此，人皮膚成纖維細胞的存活率和膠原蛋白的產率是被 廣泛應用認可的一種評價皮膚衰老狀態的模型。
[0004] 生物活性肽具有多種人體代謝和生理調節功能，易消化吸收，有促進免疫調節、抗 菌、降血壓、抗癌、抗氧化等功效，是由25個天然氨基酸通過肽鍵以不同組成和排列方式構 成的二肽到復雜的線性、環形結構的不同肽類的總稱。活性肽安全性極高，是當前國際食品 界最熱門的研究課題和極具發展前景的功能因子。現代營養學表明，蛋白質經消化道酶作 用后并不完全以游離氨基酸的形式吸收，大多以低肽的形式吸收，并且低肽比游離氨基酸 具有更高的營養價值和生物效價。雖然，活性肽被廣泛應用在化妝品中，但是，本發明中的 序列是首次發現，并具備該功效的多肽。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種具有保護紅細胞溶血以及促進人皮膚成纖維細胞的增 殖和膠原蛋白產生的合成五肽，可應用于生物制藥與化妝品等領域。本發明以APPH誘導的 紅細胞溶血實驗以及紫外損傷人皮膚成纖維細胞來評價多肽的抗氧化及抗皮膚衰老活性。
[0006] 本發明所述的合成五肽縮寫為FFEFF，分子量735. 32。序列為： Phe-Phe-Glu-Phe-Phe。其中， Phe表示英文名稱為phenylalanine，中文名稱為苯丙氨酸的氨基酸的相應殘基； Glu表示英文名稱為Glutamicacid，中文名稱為谷氨酸的氨基酸的相應殘基。
[0007] 本發明所述的氨基酸序列采用標準Fmoc方案，通過樹脂的篩選，合理的多肽合成 方法。將目標多肽的C-端羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這個 氨基酸的氨基作為起點，與另一分子氨基酸的羧基作用形成肽鍵。不斷重復這一過程，即可 以得到目標多肽產物。合成反應完成后，去除保護基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標產物。 多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，固相合成順序從C端向N端合成。采用高效液相 色譜進行純化，液氮速凍，冷凍干燥，得到成品合成五肽。
[0008] 本發明將終濃度為1-100Pg/mL的合成五肽與正常人血紅細胞混勻，孵育，經 AAPH損傷2h后，使得細胞溶血抑制率最高可達到82.0 ±1.03%。用100噸/mL的合成五 肽處理組與僅用AAPH損傷的紅細胞組相比，其形貌比單純AAPH處理組光滑，有序。用5 呢/111]^合成五肽處理，紅細胞300活力由 2.5976 11^。1'〇1:/111]^上升到 5.6877 11^。1'〇1:/1111， 結果表明，合成五肽處理后紅細胞的S0D活性有較大提高，可在生物醫藥與化妝品等領域 應用。
[0009] 本發明將濃度為1-10Pg/mL的合成五肽加入人皮膚成纖維細胞培養液中孵育，經 中波紫外（UVB) 80mJ/cm2損傷后，與模型組相比，樣品組細胞存活率提高了 0-18. 62%。同 時，膠原蛋白得率提高了 4. 69-9. 8%。
[0010] 與現有技術相比，本發明具有如下優點和技術效果： 本發明首次合成了該肽，并且應用于AAPH損傷的正常人紅細胞進行保護，使得紅細胞 溶血率顯著降低，S0D活性有較大的提高，同時，合成五肽對紫外損傷的人皮膚成纖維細胞 的生長具有促進作用，同時能促進其膠原蛋白的產生。
【附圖說明】
[0011] 圖 1 為合成五肽Phe-Phe-Glu-Phe-Phe的T0F圖譜。
[0012] 圖2為添加合成五肽進行預保護后進行AAPH損傷的正常人紅細胞溶血抑制率變 化曲線，其中橫坐標為Concentration(濃度）、縱坐標為Hemolysisinhibition(溶血抑制 率
[0013] 圖3為不同處理組紅細胞的原子力顯微鏡（AFM)成像圖。
【具體實施方式】
[0014] 以下結合具體實例對本發明作進一步說明，但本發明的實施和保護范圍不限于 此。對于未特別注明的工藝參數，可參照常規技術進行。
[0015] 合成五肽固相合成 選用高分子樹脂（中肽生化有限公司)，按照氨基酸序列Phe-Phe-Glu-Phe-Phe的特征， 先將Phe的羧基以共價鍵的形式與一個樹脂相連，然后Phe的氨基和Phe的羧基縮水反應， 處理后，再添加Glu，Phe的氨基和Glu的羧基反應，依次從右到左添加氨基酸，加好最后一 個Phe氨基酸后，再切除樹脂即得到目標合成五肽。高效液相色譜純化得到最后的產品，純 化過程使用PhenomenexC1S (4. 6*250mm)色譜柱，流速為1.0mL/min。采用兩個通道進行 洗脫，溶劑A:含有0. 1%三氟乙酸的水；溶劑B:含有0. 09%三氟乙酸的溶液（80%乙腈 +20%水）；洗脫梯度過程中B初始比例為39%，在20min內，B的比例上升到49%，檢測波長 220nm。收集合成五肽溶液，液氮速冷，然后凍干。得到純度為95%以上的產品，并經ESI-MS 鑒定結構(如圖1所示)。
[0016] 合成五肽對人皮膚成纖維細胞UVB損傷的保護應用 人皮膚成纖維細胞培養在完全培養基中，完全培養基主要由基礎培養基高糖DMEM， 10%胎牛血清（v/v)，以及1%雙抗（由青霉素和鏈霉素組成，v/v)組成。置于37 °C、C02 體積分數為5%的飽和濕度培養箱中。每隔2d換液1次。待細胞長滿培養平的90%左右， 取其接種于96孔培養板中，每孔lOOyL，濃度為5X104cells/mL。細胞生長24h后， 吸棄培養液，用200yLPBS洗1次，加入200yLPBS，用80mj/cm2UVB照射，吸棄PBS，每 孔加入200yL10yg/mL樣品（零濃度用完全培養基取代，即為正常對照)，繼續培養72h， 吸棄培養液，采用MTT法檢測細胞存活率，結果見表1。
[0017] 表 1
合成五肽促進UVB損傷人皮膚成纖維細胞膠原蛋白產生的應用 取上述處理組的細胞，吸棄培養液，用無菌水洗細胞表面兩次，加入冰冷70%乙醇 200yL進行固定，在-80 °C冰箱放置至少lOmin，取出后，用無菌水洗細胞表面兩次，風干 水分后，每孔加入200yL1%飽和苦味酸-猩紅染液（m/v)，于4°C條件下輕晃24h，吸棄 染液，用無菌水洗3次，直至沒有染色液洗出為止，加入150yL1MNaOH溶液，150r/min， 震蕩15min，每孔取出100yL置于96孔板中，測定492nm處的吸光度值，