具有血管緊張素轉化酶抑制活性的扁杏仁肽及其制備方法【
技術領域：
】[0001]本發明屬于醫用蛋白或肽/蛋白
技術領域：
，具體涉及兩種具有顯著的血管緊張素轉化酶（ACE)抑制活性的扁杏仁肽及其制備方法。【
背景技術：
】[0002]目前，天然生物活性肽研究的蛋白來源主要有：（1)植物性來源：大豆/豆柏、米糟、花生、杏仁等；（2)動物性來源：蠶絲、豬肉、雞肉、動物皮/骨、動物毒液等。[0003]生物活性肽的作用研究方向主要有：（1)抗高血壓活性；（2)抗氧化活性；（3)抗血栓活性；(4)抗菌作用；（5)免疫作用；(6)拮抗與抗拮抗活性；（7)抗炎癥作用等。[0004]以上成果大多停留在色譜分析水平，沒有制取到足夠的純凈樣品。有的僅進行了體外或細胞活性研究兩者中的一項，不能充分證明產物的安全和有效性。【
發明內容】[0005]本發明所要解決的技術問題在于提供兩種具有顯著的血管緊張素轉化酶抑制活性的扁杏仁肽，以及這兩種扁杏仁肽的制備方法。[0006]解決上述技術問題所采用的技術方案是：該扁杏仁肽的氨基酸序列為a-His-Thr-Asp-Asp，其中a代表Met或Gin。[0007]本發明具有血管緊張素轉化酶抑制活性的扁杏仁肽的制備方法由下述步驟組成：[0008]1、提取扁杏仁蛋白[0009]將扁杏仁依次經熱水脫皮、粉碎、脫脂、溶劑提取、乙醇和等電點沉降法復合沉淀、冷凍干燥，得到扁杏仁蛋白。[0010]2、蛋白酶解[0011]將步驟1得到的扁杏仁蛋白先用Protamex復合蛋白酶水解，然后用Alcalase堿性蛋白酶水解，離心分離，上清液冷凍干燥，得到扁杏仁總肽。[0012]3、葡聚糖凝膠層析[0013]將步驟2得到的扁杏仁總肽與超純水按質量體積比為30~50g:1L混合，脫氣、超濾膜過濾后加入SephadexG-15填充柱中，以超純水為流動相，采用自動液相色譜分離層析儀進行分離，進樣量2mL，流速3mL/分鐘；收集19~40分鐘所有流出成分，冷凍干燥。[0014]4、反相制備色譜分離[0015]將步驟3冷凍干燥后得到的產品與超純水按質量體積比為40~60g:1L混合，用超濾膜過濾，超聲脫氣后，注射入制備色譜系統，進樣量lmL，采用SinochromODS-BP色譜柱分離，洗脫相A為乙腈，洗脫相B為含0.05%三氟乙酸的超純水，梯度洗脫程序：0~10分鐘，20%乙腈；10~30分鐘，20%~40%乙腈；30~40分鐘，40%~70%乙腈；流速12mL/分鐘；收集8.52~9.14分鐘和14.87~15.26分鐘流出的兩種成分，冷凍干燥，得到氨基酸序列為Met-His-Thr-Asp-Asp和Gln-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽。[0016]本發明的扁杏仁蛋白可根據現有文獻公開的任意一種提取方法提取。[0017]本發明以扁杏仁為原料，先提取扁杏仁蛋白，再將扁杏仁蛋白酶解后得到的扁杏仁總肽經葡聚糖凝膠層析、反相制備色譜分離得到兩種扁杏仁肽。實驗結果表明，所制備的兩種扁杏仁肽具有較高的ACE抑制活性，其中氨基酸序列為Met-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽對ACE抑制活性的IC5。值為67.52±0.05yg/mL，氨基酸序列為Gln-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽對ACE抑制活性的IC5。值為43.18±0.07yg/mL，且細胞毒性較低，因而可以作為降壓藥物。【具體實施方式】[0018]下面結合實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明的保護范圍不僅限于這些實施例。[0019]實施例1[0020]1、提取扁杏仁蛋白[0021]根據公布號為CN102845585A、發明名稱為"聚乙二醇-微波輔助提取杏仁蛋白的方法"中實施例1公開的方法提取扁杏仁蛋白。[0022]2、蛋白酶解[0023]將扁杏仁蛋白與蒸餾水按質量體積比為40g:1L混合，在溫度為42°C水浴中先用Protamex復合蛋白酶在pH值為6.5下水解100分鐘，加酶量為53140U/g蛋白，水解完后在沸水浴中滅酶20分鐘，然后在溫度為53°C的環境中用Alcalase堿性蛋白酶在pH值為7.6下酶解90分鐘，加酶量為1130U/g蛋白，酶解完后在沸水浴中滅酶20分鐘，酶解過程用0.5mol/LNaOH水溶液調節pH值；10000轉/分鐘離心分離20分鐘，所得上清液在-40°C冷凍干燥24小時，得到扁杏仁總肽。[0024]3、葡聚糖凝膠層析[0025]將2.06g扁杏仁總肽與超純水按質量體積比為40g:1L混合，脫氣、超濾膜過濾后加入SephadexG-15填充柱中，以超純水為流動相，采用自動液相色譜分離層析儀（上海滬西分析儀器廠提供）在檢測波長為280nm、進樣量為2mL、流速為3mL/分鐘下進行分離，收集19~40分鐘所有流出成分，如此反復試驗，合并流出組分，在-40°C冷凍干燥24小時，得到產品共0.76g。[0026]4、反相制備色譜分離[0027]將步驟3葡聚糖凝膠層析中得到的0.76g產品與超純水按質量體積比為50g:1L混合，用超濾膜過濾，超聲脫氣20分鐘后，注射入島津LC-10A制備色譜系統，色譜柱為大連伊利特Sinochrom0DS-BP，檢測波長220nm，進樣量lmL，流速12mL/min，洗脫相A為乙腈，洗脫相B為超純水（含0.05wt.%三氟乙酸），梯度洗脫程序：0~10分鐘，20%(體積濃度）乙腈；10~3〇分鐘，2〇%~40%(體積濃度）乙腈；3〇~40分鐘，40%~7〇%(體積濃度）乙腈；收集8.52~9.14分鐘和14.87~15.26分鐘流出的兩種成分，在-40°C冷凍干燥24小時，得到114mg肽A和12mg肽B，經HPLC檢測證明兩種肽均為純品，經PPSQ-31A蛋白質自動檢測儀檢測，肽A的氨基酸序列為Met-His-Thr-Asp-Asp，肽B的氨基酸序列為Gln-His-Thr-Asp-Asp〇[0028]發明人對實施例1得到的肽A和肽B分別進行體外和細胞實驗，具體實驗情況如下：[0029]1、體外ACE抑制活性[0030]在37°C下，ACE可以與馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL)相互作用，將其降解為馬尿酸（HA)，即同等條件下，一個物質如果使得ACE-HHL體系中轉化出的HA越少，其ACE抑制性越強，即HA峰面積越小，物質的ACE抑制性越強。[0031]將肽A和肽B分別用pH值為8.3的硼酸緩沖液配制成5yg/mL、10yg/mL、50yg/mL、100iig/mL、150iig/mL5個濃度，作為樣品溶液。向2mL離心管中加入120iiL5mmol/LHHL和40yL樣品溶液，于37°C水浴恒溫6min，加入100yL0.lU/mL的ACE溶液（用pH值為8.3的硼酸緩沖液配制），于恒溫磁力攪拌器中37°C恒溫4000r/min攪拌反應60min，加入160yL1.Omol/LHC1水溶液反應lOmin，終止反應后用超濾膜過濾，濾液用Watersl525高效液相色譜儀測定HA，色譜條件：WatersPDA2996二極管陣列檢測器；美國安捷倫Agilent300Stable_bondC18大孔色譜柱；進樣量20yL;流速lmL/min;檢測波長228nm;流動相A為乙腈，流動相B為超純水，兩者均含0.05%TFA;梯度洗脫程序：0~40min，10%~45%乙腈。同時pH值為8.3的硼酸緩沖液做空白對照試驗。每個實驗平行測定3次取平均值。用SPSSStatistics進行統計，分別擬當前第1頁1 2