使用多重細胞信號傳導途徑活性的治療應答的醫學預后和預測的制作方法
【專利說明】使用多重細胞信號傳導途徑活性的治療應答的醫學預后和 預測 發明領域
[0001] 本文描述的主題主要涉及生物信息學、基因組處理領域、蛋白質組學處理領域和 相關領域。
[0002] 發明背景 基因組和蛋白質組學分析已基本實現，且提出醫學領域例如腫瘤學中的臨床應用的潛 在希望，其中多種癌癥已知與基因組突變/變異/異常甲基化模式的特異性組合和/或特 異性基因的高或低表達水平相關，所述特異性基因在癌癥的生長和進化例如細胞增殖和轉 移中起作用。例如，Wnt信號傳導途徑影響細胞增殖的調節，并且是高度調節的。由于調節 喪失導致的高Wnt途徑活性已與癌癥關聯，在所述癌癥中有惡性結腸腫瘤。雖然不限于任 何具體操作理論，但認為惡性腫瘤細胞中的Wnt途徑失調導致高Wnt途徑活性，其依次又 引起惡性結腸細胞的細胞增殖，即結腸癌的傳播。另一方面，例如在骨質疏松癥的情況下， 異常低的途徑活性也可能是有利的。在健康和疾病中的細胞分裂、功能和/或分化中起相 似作用的其他途徑是細胞信號傳導途徑(例如ER、PR、AR、PPAR、GR、VitD、TGFbeta、Notch、 Hedgehog、FGF、NF K B、VEGF 和 PDGF)。
[0003] 獲得基因組和蛋白組學數據的技術在臨床背景下已變得容易獲得。例如，通過微 陣列的測量常規用于評價基因表達水平、蛋白質水平、甲基化等等。自動化的基因測序允許 DNA和mRNA中的遺傳變異/突變/異常甲基化模式的成本有效的鑒定。在基因測序期間的 mRNA水平的定量評價帶來作為用于評價基因表達水平的臨床工具的希望。
[0004] 治療學家例如腫瘤科醫生的主要挑戰之一是對患者的預后作出有根據的猜測，因 為這種信息影響治療選擇。基于個別患者癌癥組織樣品的基因組學、轉錄組學和蛋白質組 學（以及其他"組學"）分析，提供了可以潛在地促成患者的預后評價的信息。然而，解釋這 些復雜數據以提取有關臨床信息已證明為挑戰，在很大程度上仍是未解決的。患者預后可 以以幾種方法以定量方式得到指示，如例如："復發時間"、或"轉移時間"、或"存活時間"、或 "由于疾病或治療的死亡風險"。
[0005] 發明概述 本發明提供了如本文公開的新的和改良的方法和儀器。
[0006] 依照本發明的主要方面，上述問題通過用于測定風險得分的具體方法得到解決， 所述風險得分指示臨床事件將在某一時間段內發生的風險，所述方法即包括下述的方法： 至少基于在受試者的組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中測量的細胞信號傳導途 徑的一種或多種靶基因的表達水平，推斷受試者的組織和/或細胞和/或體液中的兩個或 更多個細胞信號傳導途徑的活性，和 測定指示臨床事件將在某一時間段內發生的風險的風險得分，其中所述風險得分至少 部分基于推斷活性的組合， 其中所述細胞信號傳導途徑包含Wnt途徑、ER (雌激素受體）途徑、HH (Hedgehog)途 徑和/或AR (雄激素受體）途徑， 其中所述細胞信號傳導途徑包含ER途徑、Wnt途徑和HH途徑，并且其中所述風險得分 這樣進行限定，使得臨床事件將在某一時間段內發生的所示風險隨著A#曾加而減少，并且 隨著max (Z5fct、/^)增加而增加， 其中仏、尸_和仏分別指示ER途徑、Wnt途徑和HH途徑的推斷活性。
[0007] 受試者可以是人或動物，并且特別是醫療受試者。此外，"靶基因"可以是"直接靶 基因"和/或"間接靶基因"（如本文描述的)。
[0008] Wnt途徑、ER途徑、HH途徑和AR途徑優選定義為細胞信號傳導途徑，其最終導致 與途徑相關的轉錄因子（TF)復合物的轉錄活性。優選地，這些分別由至少(6-連環蛋白/ TCF4、ERa二聚體、GLI家族成員和AR組成。
[0009] 受試者的組織和/或細胞和/或體液中的細胞信號傳導途徑活性的推斷可以例如 尤其通過下述執行：（i)評估代表一組輸入的細胞信號傳導途徑的概率模型(優選貝葉斯 網絡）的至少一部分，所述一組輸入包括至少在受試者的組織和/或細胞和/或體液中（例 如在組織載玻片或細胞上的染色)，或者在組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中，測量 的細胞信號傳導途徑的一種或多種靶基因的表達水平，（ii)估計受試者的組織中的至少一 種轉錄因子（TF)元件的水平，所述至少一種TF元件控制細胞信號傳導途徑的一種或多種 靶基因的轉錄，所述估計至少部分基于關于至少一種TF元件的條件概率，以及在受試者的 提取樣品中測量的細胞信號傳導途徑的一種或多種靶基因的表達水平，和（iii)基于在組 織樣品和/或細胞樣品和/或體液樣品中估計的轉錄因子水平，推斷細胞信號傳導途徑的 活性。這在公開的歐洲專利申請EP 2 549 399 Al("Assessment of Wnt pathway activity using probabilistic modeling of target gene expressions'，），且特別是公開的國際 專利申請 TO 2013/011479 A2 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression'，）中詳細描述，所述專利的 內容隨同整體引入。
[0010] 在示例性替代方案中，在受試者的組織和/或細胞和/或體液中的細胞信號傳導 途徑中的一種或多種的活性的推斷可以例如尤其通過下述執行：（i)在受試者的組織和/ 或細胞和/或體液的提取樣品中，測定轉錄因子（TF)元件的水平，該TF元件控制細胞信號 傳導途徑的一種或多種靶基因的轉錄，測定至少部分基于評估將細胞信號傳導途徑的一種 或多種基因的表達水平與TF元件的水平關聯的數學模型，該模型至少部分基于一種或多 種靶基因的表達水平的一種或多種線性組合，和（ii)基于在受試者的組織和/或細胞和/ 或體液的提取樣品中測定的TF元件水平，推斷在受試者的組織和/或細胞和/或體液中 的細胞信號傳導途徑的活性。這在未公開的美國臨時專利申請US 61/745839,相應的未公 開的國際專利申請 PCT/IB2013/061066 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination (s) of target gene expressions'，）中詳細描述。
[0011] 優選地，細胞信號傳導途徑包含在癌癥中起作用的至少一個細胞信號傳導途徑。
[0012] 特別優選的是其中細胞信號傳導途徑包含Wnt途徑和/或HH途徑的方法，并且其 中風險得分這樣進行限定，使得臨床事件將在某一時間段內發生的所示風險隨著Wnt途徑 的推斷活性增加而增加，和/或隨著HH途徑的推斷活性增加而增加。
[0013] 還特別優選的是其中細胞信號傳導途徑包含ER途徑的方法，并且其中風險得分 這樣進行限定，使得臨床事件將在某一時間段內發生的所示風險隨著ER途徑的推斷活性 增加而減少。
[0014] 進一步優選的是其中推斷活性的組合包含下述表達的方法 -a?Per + ?maxiPWnt,PHH), 其中/^、/^和分別指示ER途徑、Wnt途徑和HH途徑的推斷活性，Q和々是非負 常數比例因子，并且臨床事件將在某一時間段內發生的所示風險隨著表達的值增加而單純 增加。
[0015] 特別優選的是這樣的方法，其中所述推斷包括： 至少基于在受試者的組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中測量的Wnt途徑的一 種或多種，優選至少三種靶基因的表達水平，推斷受試者的組織和/或細胞和/或體液中的 Wnt 途徑的活性，所述靶基因選自下述：KIAAl 199、AXIN2、RNF43、TBX3、TDGFl、S0X9、ASCL2、 IL8、SP5、ZNRF3、KLF6、CCND1、DEFA6 和 FZD7， 和/或 至少基于在受試者的組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中測量的ER途徑的一種 或多種，優選至少三種靶基因的表達水平，推斷受試者的組織和/或細胞和/或體液中的ER 途徑的活性，所述靶基因選自下述：GREBI、PGR、XBPI、CA 12、SOD I、CTSD、IGFBP4、TFFI、SGK3、 NRIP1、CELSR2、WISP2 和 AP1B1， 和/或 至少基于在受試者的組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中測量的HH途徑的一種 或多種，優選至少三種靶基因的表達水平，推斷受試者的組織和/或細胞和/或體液中的HH 途徑的活性，所述靶基因選自下述：GLIl、PTCHl、PTCH2、IGFBP6、SPPl、CCND2、FST、FOXLl、 CFLAR、TSC22D1、RAB34、S100A9、S100A7、MYCN、FOXMl、GLI3、TCEA2、FYN和 CTSLl， 和/或 至少基于在受試者的組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中測量的AR途徑的一種 或多種，優選至少三種靶基因的表達水平，推斷受試者的組織和/或細胞和/或體液中的 AR 途徑的活性，所述靶基因選自下述：KLK2、PMEPAI、TMPRSS2、NKX3_1、ABCC4、KLK3、FKBP5、 ￡讓2、邯了2815、011〇?24、？？厶？2厶、燦1?1、1^161、〇?8314、1^^1、（；1^^認3、厶1?和￡八卩2。
[0016]進一步優選的是這樣的方法，其中所述推斷進一步基于： 在受試者的組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中測量的Wnt途徑的至少一種靶 基因的表達水平，所述靶基因選自：NKD1、OAT、FAT1、LEF1、GLUL、REGIB、TCF7L2、C0L18A1、 BMP7、SLC1A2、ADRA2C、PPARG、DKKl、HNFlA 和 LECT2， 和/或 在受試者的組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中測量的ER途徑的至少一種靶基 因的表達水平，所述靶基因選自：RARA、MYC、DSCAM、EBAG9、C0X7A2L、ERBB2、PISD、KRT19、 HSPBl、TRIM25、PTMA、C0L18A1、CDH26、NDUFV3、PRDM15、ATP5J 和 ESRl， 和/或 在受試者的組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中測量的HH途徑的至少一種靶基 因的表達水平，所述靶基因選自：BCL2、F0XA2、FOXFl、H19、HHIP、IL1R2、JAG2、JUP、MIF、 MYLK、NKX2. 2、NKX2. 8、PITRMl 和 T0M1， 和/或 在受試者的組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中測量的AR途徑的至少一種靶基 因的表達水平，所述靶基因選自：APP、NTS、PLAU、CDKNIA、DRGI、FGF8、IGFI、PRKACB、PTPN1、 SGKl 和 TACC2。
[0017] 本發明的另一個方面涉及進一步包括下述的方法(如本文描述的）： 將受試者指定至與不同所示風險相關的多個風險組中的至少一個，所述風險指示臨床 事件將在某一時間段內發生， 和/或 至少部分基于臨床事件將在某一時間段內發生的所示風險，決定對于受試者推薦的治 療。
[0018] 本發明還涉及包括下述的方法(如本文描述的）： 至少基于在受試者的組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中測量的Wnt途徑的一組 靶基因的兩種、三種或更多種靶基因的表達水平，推斷受試者的組織和/或細胞和/或體液 中的Wnt途徑的活性， 和/或 至少基于在受試者的組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中測量的ER途徑的一組 靶基因的兩種、三種或更多種靶基因的表達水平，推斷受試者的組織和/或細胞和/或體液 中的ER途徑的活性， 和/或 至少基于在受試者的組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中測量的HH途徑的一組 靶基因的兩種、三種或更多種靶基因的表達水平，推斷受試者的組織和/或細胞和/或體液 中的HH途徑的活性， 和/或 至少基于在受試者的組織和/或細胞和/或體液的提取樣品中測量的AR途徑的一組 靶基因的兩種、三種或更多種靶基因的表達水平，推斷受試者的組織和/或細胞和/或體液 中的AR途徑的活性。
[0019] 優選地， Wnt途徑的靶基因的組包含選自下述的至少九種，優選全部靶基因：KIAA1199、AXIN2、 RNF43、TBX3、TDGF1、S0X9、ASCL2、IL8、SP5、ZNRF3、KLF6、CCND1、DEFA6 和 FZD7， 和/或 ER途徑的靶基因的組包含選自下述的至少九種，優選全部靶基因：GREB1、PGR、XBP1、 CA12、SODl、CTSD、IGFBP4、TFFl、SGK3、NRIPl、CELSR2、WISP2 和 APlBl， 和/或 HH途徑的靶基因的組包含選自下述的至少九種，優選全部靶基因：GLI1、PTCH1、 PTCH2、IGFBP6、SPPl、CCND2、FST、FOXLl、CFLAR、TSC22D1、RAB34、S100A9、S100A7、MYCN、 FOXMl、GLI3、TCEA2、FYN 和 CTSLl， 和/或 AR途徑的靶基因的組包含選自下述的至少九種，優選全部靶基因：KLK2、PMEPA1、 TMPRSS2、NKX3_1、ABCC4、KLK3、FKBP5、ELL2、UGT2B15、DHCR24、PPAP2A、NDRGl、LRIGl、
[0020] 特別優選的是這樣的方法，其中 Wnt途徑的靶基因的組進一步包括選自下述的至少一種靶基因：NKD1、OAT、FAT1、 LEFl、GLUL、REGlB、TCF7L2、C0L18A1、BMP7、SLC1A2、ADRA2C、PPARG、DKKl、HNFlA 和 LECT2、 和/或 ER途徑的靶基因的組進一步包括選自下述的至少一種靶基因：RARA、MYC、DSCAM、 EBAG9、C0X7A2L、ERBB2、PISD、KRT19、HSPBI、TR頂25、PTMA、COL18AI、CDH26、NDUFV3、PRDMl5、 ATP5J 和 ESR1， 和/或 HH途徑的靶基因的組進一步包括選自下述的至少一種靶基因：BCL2、F0XA2、F0XF1、 H19、HHIP、IL1R2、JAG2、JUP、MIF、MYLK、NKX2. 2、NKX2. 8、PITRMl 和 T0M1， 和/或 AR途徑的靶基因的組進一步包括選自下述的至少一種靶基因：APP、NTS、PLAU、 CDKN1A、DRG1、FGF8、IGF1、PRKACB、PTPN1、SGKl 和 TACC2。
[0021] 待依照本發明使用的樣品可以是優選經由活組織檢查操作或其他樣品提取操作， 例如得自癌癥病變，或懷疑癌癥的病變，或轉移性腫瘤，或其中存在被癌細胞污染的流體的 體腔(例如胸膜腔或腹腔或者膀胱腔)，或含有癌細胞的其他體液等等的樣品。樣品由其提 取的細胞還可以是來自血液系統惡性腫瘤(例如白血病或淋巴瘤)的腫瘤細胞。在一些情況 下，細胞樣品還可以是循環腫瘤細胞，即已進入血流且可以使用合適的分離技術(例如血漿 分離置換法（apheresis)或常規靜脈抽血)提取的腫瘤細胞。除血液之外，樣品由其提取的 體液可以是尿、胃腸內容物或滲出液。如本文使用的，術語"提取的樣品"還涵蓋這樣的情 況，其中受試者的組織和/或細胞和/或體液已取自受試者并且例如已置于顯微鏡載玻片 上，并且其中為了執行請求保護的方法，例如借助于激光捕獲顯微切割（LCM)，或通過從載 玻片上刮取目的細胞來提取該樣品的一部分，或通過熒光激活細胞分選技術。
[0022] 進一步優選的是這樣的方法，其進一步包括組合風險得分和/或推斷活性中的至 少一種與得自一種或多種另外的預后測試的一種或多種另外的風險得分，以獲得組合的風 險得分，其中所述組合的風險得分指示臨床事件將在某一時間段內發生的風險。一種或 多種另外的預后測試可以特別包含Oncotype DX?乳腺癌測試、