雜交蕓苔屬植物及其生產方法
【專利說明】雜交蕓苔屬植物及其生產方法 發明領域
[0001] 本發明涉及轉基因的蕓苔屬植物、植物材料和種子，特別是油籽油菜（oilseed rape)植物，其特征在于這些植物包含兩個特定轉化事件的組合，具體為在蕓苔屬基因組特 定位置存在雄性不育基因，和在蕓苔屬基因組另一特定位置存在育性恢復基因。本發明還 涉及一對轉基因蕓苔屬植物，特別是油籽油菜植物，其特別適于生產雜交種子。更具體地， 一種植物的特征為雄性不育，因為在其基因組中存在雄性不育基因，而另一種植物的特征 為攜帶可阻止雄性不育基因活性的育性恢復基因。本發明的這對蕓苔屬植物將形成雜交種 子的能力與最佳總體農學性能、遺傳穩定性以及對不同遺傳背景的適應性相結合。
[0002] 發明背景
[0003] 轉基因在植物中的表型表達由該基因自身的結構及其在植物基因組中的位置來 決定。同時，（外源DNA中的）轉基因在基因組的不同位置存在，可以以不同方式影響植物 的總體表型。通過遺傳操作對植物從農業上或工業上成功導入商業感興趣的性狀是一個漫 長的、受不同因素影響的過程。經遺傳轉化的植物的實際轉化和再生只是一系列選擇步驟 的第一步，其中所述選擇步驟包括廣泛的遺傳鑒定、育種及野外試驗的評估。
[0004] 術語"油菜籽"（rapeseed)涵蓋蕓苔屬物種的各種種子。蕓苔屬（植物）作為最 有價值的油料作物在從中國和印度到芬蘭和加拿大廣泛種植。多數蕓苔屬種類屬于十字花 科家族。它們起源于二倍體物種，具有從7(地中海包心菜（Brassica fruticulosa))到 12 (白芥（Sinapsis alba))的非整倍體（aneuploid)染色體數。在加拿大最廣泛種植的蕓 苔屬物種為憲菁（turnip rape)，或 Brassica campestris(aa，n = 10)。甘藍（Brassica oleracea) (cc，n = 9)在近期進化史中分化為至少六種園藝種類，包括椰菜，花椰菜和甘藍 (cabbage)。黑芥（Brassica nigra) (bb，n = 8)或稱黑芥（black mustard)是商業上的 較不重要的作物，主要以其種子為人所知，芥末起初由其種子制得。從這些基本種類，在更 近期的進化階段中通過互交（intercross)產生雙倍體雜種（amphiploid)。這之中最重要 的是歐洲油菜（Brassica napus) (aacc)以及芥菜（Brassica juncea) (aabb)或稱褐芥菜 (brown mustard)，前者的冬季種類在北歐提供了最高的油菜籽產量，后者為印度次大陸主 要的油料作物之一。盡管不同蕓苔屬物種（特別是那些基因組相容的）之間的互交是可 能的，并且經常出于育種目的進行互交，但不是所有的性狀（或基因）都能夠從一個物種轉 移到另一物種，或在轉移到不同物種時，不是所有的特性（或基因）都能夠保持相同的特征 (或表達模式）。因此，在一個蕓苔屬物種中賦予天然或嵌合基因最佳表達的遺傳基因座， 在另一物種中不一定具有相同的效果。
[0005] 蕓苔屬物種為兩性的，一般60-70%為自花傳粉。作為選擇基礎，雜交體的產生和 遺傳變異的導入通常依賴于對自然發生現象（例如自身不相容性和細胞質雄性不育）的適 應。在蕓苔屬育種中未廣泛使用人工授粉控制法例如手工去雄或使用殺配子劑，分別是因 為它們有限的實用性和高成本。
[0006] 已開發了用于產生雄性或雌性不育植物的轉基因方法，它們提供了有意義的常規 技術替代方法。
[0007] EP 0, 344, 029描述了用于獲得核雄性不育的體系，其中將植物用雄性不育基因 轉化，所述雄性不育基因包含例如在絨氈層（tapetum)特異啟動子TA29控制下的編碼 芽孢桿菌RNA酶分子的DNA，當該基因摻入植物中后，可選擇性破壞絨氈層細胞。用此 基因轉化煙草及油籽油菜植物導致花粉形成完全受阻的植物（Mariani等，1990, Nature 347:737-741)。
[0008] De Block和De Brouwer (1993, Planta 189:218-225)描述了包含嵌合PTA29:芽 孢桿菌RNA酶基因的歐洲油菜植物花藥發育的細胞化學和組織化學分析。
[0009] 為恢復雄性不育植物之子代的育性，開發了這樣的體系，其中雄性不育植物與攜 帶育性恢復基因的轉基因植物雜交，育性恢復基因在表達時可抑制或阻止雄性不育基因的 活性（US5, 689, 041;US5, 792, 929 ;De Block和De Brouwer,同上）。WO 96/26283中描 述了在雄性不育植物的生產中使用共同調節的（多個）基因以增加具有良好農藝學性狀的 轉化體的（產生）頻率。典型地，當不育性DNA編碼芽孢桿菌RNA酶，共同調節的DNA將編 碼芽孢桿菌RNA酶抑制劑。
[0010] 原種事件MS-B2,和包含賦予雄性不育性的此原種事件的雄性不育植物，在 TO01/31042中詳細描述（在此引入作為參考），包括轉基因和所插入的轉基因緊側翼的植 物DNA序列的表征。
[0011] 包含原種事件MS-B2的參考種子以ATCC保藏號PTA-850于1999年10月14日保 藏于ATCC(10801 University Blvd.，Manassas, VA 20110-2209)。同一種子的另一樣品以 保藏號PTA-2485保藏。MS-B2的備選名字為MS 11。
[0012] 原種事件RF-BN1，和包含賦予雄性不育性的此原種事件的雄性不育植物，在 TO01/41558中詳細描述（在此引入作為參考），包括轉基因和所插入的轉基因緊側翼的植 物DNA序列的表征。
[0013] 包含原種事件RF-BNl的參考種子以ATCC保藏號PTA-730于1999年9月20日保 藏于 ATCC(10801University Blvd. ,Manassas,VA 20110-2209)。RF-BNl的備選名字為Rf 3〇
[0014] W001/41558還描述了原種事件MS-BN1，包含該事件的雄性不育植物，以及鑒定這 樣的植物及其子代的方法。MS-BNl的備選名字為MS 8。
[0015] MS-BNl和RF-BNl事件包含在以商標名InVigor?Canola出售的雜交歐洲油菜 植物中。
[0016] 前述這些文件既未描述蕓苔屬植物中MS-B2和RF-BNl的具體組合，也未描述其在 雜交種子生產中的用途。迄今也未提及芥菜中的RF-BNl，以及MS-B2增加蕓苔屬油料種子 植物產量的用途。
[0017] 發明概述
[0018] 在一個實施方案中，本發明提供了從油籽油菜植物，例如歐洲油菜或芥菜生產雜 交種子的方法，包含如下步驟，提供包含原種事件MS-B2的雄性不育的雌性親本油籽油菜 植物，包含所述原種事件的參考種子以保藏號ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于 ATCC;提供包含原種事件RF-BNl的雄性不育的雄性親本油籽油菜植物，優選為純合形式， 包含所述原種事件的參考種子以保藏號ATCC_PTA-730保藏于ATCC ;用來自所述雄性親本 油籽油菜植物的花粉對所述雌性親本油籽油菜植物進行授粉；并從所述雌性親本植物收獲 雜交種子。
[0019] 在另一實施方案中，本發明提供了油籽油菜植物，例如歐洲油菜或芥菜植物，其 核基因組中包含至少一個拷貝的原種事件MS-B2,包含該原種事件的參考種子以保藏號 ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC，還包含至少一個拷貝的原種事件RF-BN1，包 含該原種事件的參考種子以保藏號ATCC_PTA-730保藏于ATCC。本發明還提供了這樣的油 籽油菜植物的細胞或組織或種子。
[0020] 在本發明的另一實施方案中，提供了一對油籽油菜植物，以用于生產雜交種子，其 中一種植物包含原種事件MS-B2,包含該原種事件的參考種子以保藏號ATCC_PTA 2485或 ATCC_PTA-850保藏于ATCC，另一種所述油籽油菜植物包含原種事件RF-BNl，包含該原種事 件的參考種子以保藏號ATCC_PTA-730保藏于ATCC。
[0021] 本發明的目的還在于提供油籽油菜植物，例如歐洲油菜或芥菜植物的基因組DNA， 其核基因組中包含至少一個拷貝的原種事件MS-B2,包含該原種事件的參考種子以保藏號 ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC，還包含至少一個拷貝的原種事件RF-BN1，包 含該原種事件的參考種子以保藏號ATCC_PTA-730保藏于ATCC。
[0022] 本發明還提供了包含原種事件RF-BNl的芥菜，及其細胞和種子，包含該原種事件 的參考種子以保藏號ATCC_PTA-730保藏于ATCC。這樣的植物還可包含原種事件MS-B2,包 含該原種事件的參考種子以保藏號ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC。
[0023] 本發明還提供了原種事件MS-B2的用途，用于提高轉基因油籽油菜植物例如芥菜 植物的種子產量，包含該原種事件的參考種子以保藏號ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保 藏于ATCC。
[0024] 在本發明另一實施方案中，提供了增加油籽油菜植物產量的方法，包含如下步驟， 提供具有原種事件MS-B2的油籽油菜植物，包含該原種事件的參考種子以保藏號ATCC_PTA 2485 或 ATCC_PTA-850 保藏于 ATCC。
[0025] 附圖簡述
[0026] 圖1 :應用除草劑后MS/RF雜交歐洲油菜種系的活力（vigor)比對。圖A :無草銨 膦應用。圖B: