三環核苷和由其制備的寡聚化合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及通式I描述的三環核苷和由其制備的寡聚化合物。
【背景技術】
[0002] 反義技術是用于減少特定基因產物的表達的有效手段，因此可以用于治療、診斷 和研究應用中。通常，反義技術背后的原理是反義化合物（寡核苷酸或其類似物的序列） 與革G核酸雜交并調芐基因表達的活性或功能，如轉錄和/或翻譯。無論具體機制如何，其序 列特異性使得反義化合物作為用于靶標確認和基因功能化的工具，以及作為治療劑來選擇 性地調節參與疾病發病機制的基因的表達具有吸引力。
[0003] 將化學修飾的核苷常規地引入反義化合物以增強其性質，例如核酸酶抗性、藥代 動力學或對靶RNA的親和力。
[0004] 化學修飾已提高了反義化合物的效力和功效，提高了其用于口服遞送或皮下給藥 的潛力，或減少了其潛在的副作用。增加反義化合物的效力的化學修飾允許較低劑量給藥， 降低了潛在的毒性。增加降解抗性的修飾導致從身體較慢地清除，從而允許較不頻繁的給 藥。
[0005]三環核苷的合成（Steffensetal.，HelveticaChimicaActa, 1997, 80, 2426-2439) 以及將三環核苷引入寡聚化合物已報道于文獻（Steffens等，J.Am.Chem. Soc.，1997, 119, 11548-11549!Steffens等，J.Am.Chem.Soc.，1999, 121，3249-3255; Renneberg等，J.Am.Chem.Soc. ,2002,124,5993-6002;Scheidegger等，Chem.Eur. J.，2006, 12, 8014-8023)。完全修飾的三環寡核苷酸相比未修飾的寡脫氧核苷酸顯示在胎牛 血清中對核分解降解更穩定，在細胞試驗中產生生物反義作用，如突變體P_球蛋白的拼接 恢復（Renneberg等，NucleicAcidsRes. 2002,30,2751-2757);或親環蛋白A中的外顯子跳 讀（Ittig等，NucleicAcidsResearch, 2004, 32, 346-353)〇
【發明內容】
[0006] 本文提供了具有式I的三環核苷和由其制備的寡聚化合物。更具體地，具有式I的 三環核苷用于在寡聚化合物的一個或多個位置引入。在某些實施方案中，本文提供的寡聚 化合物的特征在于一種或多種增強的性質，如核酸酶穩定性、細胞滲透性、生物利用度或毒 性。在某些實施方案中，本文提供的寡聚化合物與靶RNA的一部分雜交，導致靶RNA的正常 功能喪失。本文提供的寡聚化合物還用作診斷應用中的引物和探針。在某些實施方案中， 本文提供的包含三環核苷的寡聚物相比未修飾的DNA或RNA寡聚物顯示出顯著改善的細胞 攝取，其不依賴于轉染試劑例如脂質體。
[0007] 變量分別在本文中進行更詳細地定義。應理解的是，本文提供的具有式I的三環 核苷和寡聚化合物包括本文所公開的實施方案和所定義的變量的所有組合。
[0008] 根據本發明的第一方面，提供了通式I描述的三環核苷：
[0009]
[0010] 其中：
[0011] -Bx是雜環堿基部分；
[0012] -T1和T2之一是羥基（-0H)或被保護的羥基，且T1和T2的另一個是磷酸酯或反應 性磷基團；
[0013]-q1Nq2、q3、q4、q5、Z1和z2的至少一個是F，
[0014] _ 其它的q2、q3、q4、q5、Z1 和z2獨立地選自H、F、Cl，
[0015]z1和z2之一是H或F，且z1和z2的另一個是H、-OH、Cl、OCH3、0CF3、OCH2CH3、OCH2CF3、 OCH2-CH=CH2、O(CH2)2-OCH3'O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2'OCH2C( = 0)-N(H)CH3、OCH2C(= 〇)-N(H) - (CH2)2-N(CH3) 2或OCH2-N(H)-C( =NH)NH2。
[0016] 在某些實施方案中，Bx是嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤。根據一個實施方 案，Bx選自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤。在一個實施方案 中，Bx是當引入DNA或RNA寡聚物時代替堿基尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺 嘌呤和鳥嘌呤能形成堿基對的芳族雜環部分。
[0017] 在某些實施方案中，T1是羥基或被保護的羥基，且T2是選自H-膦酸酯或亞磷酰胺 的反應性磷基團。在某些實施方案中，T1是三磷酸酯基團且T2為0H。在某些實施方案中，T1是4, 4' -二甲氧基三苯甲基且T2是二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺。在某些實施方案中， T1是受控孔玻璃表面。根據本實施方案的優選替代方案，T1是長鏈烷基胺受控孔玻璃表面， 其通過酰胺官能與3' -0-琥珀酰化核苷連接。
[0018] 在某些實施方案中，q1和q2是H，q3、q4和q5之一是F且其它的q3、q4和q5是H。 在某些實施方案中，q1、q2、Z1和z2是H，q3、q4和q5之一是F，且其它的q3、q4和q5是H。
[0019] 在某些實施方案中，q2、q3、。4和q5是H，z1和z2之一是F且z1和z2的另一個 是H。
[0020] 在某些實施方案中，q1和q2是H，q3、q4和q5之一是F，z1和z2之一是F，且其它的 q3、q4、q5、Z1 和z2是H。
[0021] 在某些實施方案中，q1、q2、q4和q5是H，q3、Z1和z2中的一個或兩個是F，且其它的 q3、Z1 和z2是H。
[0022] 根據一個實施方案，Z1和z2之一是F、OCH3或O(CH2)2-OCH3。根據一個實施方案， Z1和z2之一是F。根據一個實施方案，Z1和z2之一是F且另一個是H。根據一個實施方案， zjpz2各為H。
[0023] 根據一個實施方案，q1和q2-起為H。根據一個實施方案，q1和q2之一是F且另 一個是H。
[0024] 本文還提供了由實施例1的化合物11示例的核苷前體化合物，具體為：
[0025]
[0026] 其中Bx選自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤。
[0027] 根據某些實施方案，三環核苷選自下組：
[0028]
[0029] 其中Bx選自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤。
[0030] 根據本發明的第二方面，提供了包含具有式II的至少一個三環核苷的寡聚化合 物：
[0031]
[0032] 其中獨立地對于式II的每個三環核苷：
[0033] -Bx是雜環堿基部分；
[0034] -T3和T4之一是將式II的三環核苷連接至寡聚化合物的核苷間連接基團，T3和T4 的另一個是羥基、被保護的羥基、5'或3'端基或者將三環核苷連接至寡聚化合物的核苷間 連接基團；
[0035]-qpq2、q3、q4、q5、Z1和z2的至少一個是F，
[0036] _其它的q2、q3、q4、q5、z1 和z2獨立地選自H、F、Cl，
[0037] -Z1 和z2之一是H或F，且z1和z2的另一個是H、-OH、Cl、0CH3、0CF3、0CH2CH3、 OCH2CF3、OCH2-CH=CH2、O(CH2) 2-0CH3、0 (CH2)2-O(CH2)2-N(CH3) 2、OCH2C( = 0)-N(H)CH3' OCH2C( = 0)-N(H) - (CH2)2-N(CH3) 2或OCH2-N(H)-C( =NH)NH2;
[0038] 且其中所述寡聚化合物包含8-40個單體亞單元。
[0039] 在本發明該方面的某些實施方案中，對于式II的每個三環核苷，Z1和z2之一是F。 在本發明該方面的某些實施方案中，對于式II的每個三環核苷，Z1和z2各自為H。
[0040] 在本發明該方面的某些實施方案中，對于式II的每個三環核苷，q1和q2各自為H。
[0041] 在本發明該方面的某些實施方案中，對于式II的每個三環核苷，q1和q2之一是F， 另一個是H。
[0042] 在本發明該方面的某些實施方案中，Bx是嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤。 根據一個實施方案，Bx選自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤。 根據一個實施方案，Bx是當引入DNA或RNA寡聚物時代替堿基尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、 5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤的能形成堿基對的芳族雜環部分。
[0043]在某些實施方案中，每個核苷間連接基團獨立地為磷酸二酯核苷間連接基團或硫 代磷酸酯核苷間連接基團。在某些實施方案中，基本上每個核苷間連接基團是硫代磷酸酯 核苷間連接基團。
[0044] 根據一個實施方案，本發明的寡聚化合物包含具有至少兩個連續的具有式II的 三環核苷的第一區域。根據一個實施方案，本發明的寡聚化合物包含具有至少兩個連續的 具有式II的三環核苷的第一區域和具有至少兩個連續的單體亞單元的第二區域，其中第 二區域中的每個單體亞單元是不同于所述第一區域的式II的三環核苷的經修飾的核苷。 根據本實施方案的另一替代方案中，寡聚化合物包含位于所述第一區域和第二區域之間的 第三區域，其中第三區域中的每個單體亞單元獨立地為不同于第一區域的式II的每個三 環核苷和第二區域的各單體亞單元的核苷或經修飾的核苷。
[0045] 根據一個實施方案，本發明的寡聚化合物包含具有6至14個連續單體亞單元的內 部區域的間隙寡聚化合物，該內部區域每側連接有1至5個連續單體亞單元的外部區域，其 中在各外部區域中的各單體亞單元是式II的三環核苷，且在內部區域中的各單體亞單元 獨立地是核苷或經修飾的核苷。
[0046] 在某些實施方案中，所述內部區域包含約8至約14個連續0-D--2'-脫氧核糖核 苷。根據一個實施方案，所述內部區域包含約9至約12個連續P-D-2' -脫氧核糖核苷。
[0047] 在某些實施方案中，對于式II的每個三環核苷，q3是F。根據一個實施方案，對于 式II的每個三環核苷，q#q5是H且q4和q5的另一個是F。
[0048]在某些實施方案中，本發明的寡聚化合物包含選自下組的一個或多個核苷酸結構 單元：
[0049]
[0051] 其中T3和T4具有如上所概括的含義。
[0052] 根據本發明的另一個方面，提供了用于固相合成寡核苷酸的方法，包括使用本發 明第一方面的三環核苷。
[0053] 在某些實施方案中，提供了包含6至14個連續單體亞單元的內部區域的間隙寡聚 化合物，該內部區域每側連接有1至5個連續單體亞單元的外部區域，其中在每個外部區域 中的每個單體亞單元是式II的三環核苷，內部區域中的每個單體亞單元獨立地是核苷或 經修飾的核苷。在某些實施方案中，內部區域包含約8至約14個連續-D-2' -脫氧核糖 核苷