轉基因玉米bt176雙重數字pcr熒光定量檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學檢測技術領域，具體地說，涉及轉基因玉米BT176雙重數 字PCR熒光定量檢測方法。
【背景技術】
[0002] 自1996年首例轉基因番茄在美國成功商業化以來，對于轉基因作物的研究近 二十年來取得了迅速的發展。根據ISAAA統計數據，截至2014年，全球轉基因作物的種植 面積已經達到1. 8億公頃，比1996年種植面積提高了近100倍，占全球作物種植總面積的 3. 4%。轉基因作物的快速發展不僅為現代農業提供了更加便利的育種方式，也由于其未知 的安全隱患引起了各個國家和地區的廣泛關注。為此，各國家和地區紛紛建立起轉基因成 分的標識制度。在全球各國家和地區制定的轉基因成分標識制度中，定量標識制度占據較 大比重，其中以歐盟和日韓最具代表性。我國在轉基因成分標識方面主要采取定性標識制 度，由于定性標識制度與定量標識制度在檢測技術等方面存在不同，使我國在作物進出口 方面容易受到國際標準的制約。為此，我國需要大力發展轉基因成分定量檢測技術并建立 相關定量標識制度。
[0003] 數字PCR(Digital-PCR)是一種新型的絕對定量PCR檢測方法，是一項檢測和定 量核酸的新技術，其基本原理是通過將微量樣品進行大倍數稀釋和分液，直至每個樣品中 所含有的待測分子數不超過1個，再將所有樣品在相同條件下進行PCR擴增，有PCR擴增 熒光信號記為1，無熒光信號記為0,有熒光信號的反應單元中至少包含一個拷貝的目標分 子，針對反應結果采用泊松分布（Poissondistribution)公式，便可計算出樣本的最初 拷貝數或濃度。該技術不依賴于擴增曲線的循環閾值，也無需看家基因和標準曲線，即可 實現DNA絕對定量。該技術在基因拷貝數變化分析（copynumbervariation,CNV)(Qin etal.，2008)、遺傳突變檢測（Yungetal.，2009)、基因分型（Loetal.，2007)、基因定 量（Warrenetal.，2010)、單細胞基因表達（Guoetal.，2010)等方面的研究取得了突破 性的發展，在臨床方面為癌癥、腫瘤等疾病檢測提供了新的診斷方法。在轉基因檢測方面， Corbisier等（2010)利用數字PCR分析了玉米種子DNA中外源基因和內參基因的拷貝數之 比，該結果與利用普通熒光定量PCR技術以質粒DNA為標準物質檢測的結果相同，證明了數 字PCR的可靠性。Burns等（2010)評估了數字PCR在轉基因檢測中檢測限（L0D)和定量限 (L0Q)，探索了數字PCR在轉基因檢測方面的可行性和反應條件，表明數字PCR能夠對起始 模板拷貝數進行絕對定量。然而利用數字PCR對轉基因檢測的研究還處于起步階段。現有 數字PCR檢測方法都需要經過樣品前處理過程，在實際檢測中，前處理過程往往會導致實 驗結果產生偏差。因此現有的數字PCR檢測方法不適合直接作為轉基因成分的檢測方法。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種不需要進行樣品前處理步驟的，針對轉基因玉米BT176 的雙重數字PCR熒光定量檢測方法，可實現對轉基因玉米品系BT176的絕對定量。
[0005] 為了實現本發明目的，本發明首先提供用于轉基因玉米BT176雙重數字PCR熒光 定量檢測的引物和探針組合，所述引物和探針組合為：
[0006]外源基因正向引物：5' -GGCCGTGAACGAGCTGTT-3'
[0007]外源基因反向引物：5' -GGGAAGAAGCCTACATGITITCTAA-3'
[0008]外源基因探針：5'-FAM-AGCAACCAGATCGGCCGACACC-BHQ1-3'
[0009] 內參基因adhl-135正向引物：5' -CGTCGITTCCCATCTCTTCCTCC-3'
[0010] 內參基因adhl-135 反向引物：5' -CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3'
[0011] 內參基因adhl-135 探針：5' -VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-BHQ1-3'。
[0012] 本發明還提供含有所述引物和探針組合的轉基因玉米BT176數字PCR雙重熒光定 量檢測試劑盒。
[0013] 優選地，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液、標準陽 性模板等中的至少一種。
[0014] 本發明進一步提供轉基因玉米BT176雙重數字PCR熒光定量檢測方法，所述方法 包括以下步驟：
[0015] 1)提取待測樣品的基因組DNA ;
[0016] 2)以提取的基因組DNA為模板，利用所述的引物和探針組合，進行數字PCR擴增反 應；
[0017]3)檢測PCR擴增產物。
[0018] 其中，數字PCR擴增反應的反應體系以4yl計為：基因組DNAlyl，225nM外 源基因正、反向引物各0. 04yl，225nM內參基因正、反向引物各0. 04yl，50nM外源基因 探針 0? 02yl，50nM內參基因探針 0? 02yl，2XMasterMix(購自Fluidigm公司）2y1， 20XLoadingReagent(購自Fluidigm公司）0? 4y1，ddH20 補足至 4y1 〇
[0019] 數字PCR擴增反應的程序為：50°C熱激活300s;95°C預變性300s;95°C變性15s， 60°C退火及延伸60s，共50個循環；在60°C下采集熒光信號。
[0020] 前述的方法，步驟3)中檢測PCR擴增產物具體如下：在數字PCR擴增反應結束后， 記錄各反應孔中外源基因和內參基因的熒光信號值，通過泊松分布公式計算各反應孔中外 源基因與內參基因的拷貝數，通過兩者的拷貝數之比得到轉基因成分的絕對濃度。
[0021] 本發明是在PCR芯片中進行數字PCR擴增反應。將每個加樣孔作為一個整體，加入 轉基因作物數字PCR擴增體系進行實時熒光擴增，通過監測每個反應孔中的熒光信號值， 獲得所有反應孔中的總體擴增曲線和熱點圖。
[0022] 檢測結果的判定按照以下方式進行：
[0023] 1、在利用數字PCR進行擴增的過程中，陽性孔的判定方法為：出現明顯區別于陰 性反應孔（陰性反應孔中模板為1y1ddH20)的擴增信號，將該反應孔記為陽性擴增孔；陽 性樣品的判定方法為：在相同樣品的三個平行組內，至少出現一組有陽性擴增孔，則表明檢 測樣品基因組中含有轉基因作物成分；
[0024] 2、在數字PCR擴增結束后，記錄每個擴增孔中外源基因和內參基因的亮點數，通 過泊松分布公式計算每個孔中外源基因與內參基因的拷貝數，通過兩者的拷貝數之比得到 轉基因成分的絕對濃度；
[0025] 3、每個樣品設置三個平行組，通過統計分析得到三個平行組內轉基因成分濃度的 相對標準偏差（1?0)，1?0<25%表明定量結果有意義；
[0026] 4、當待測樣品反應孔中為陰性結果時，表明未檢測到轉基因作物成分；當待測樣 品反應管中為陽性結果時，表明待測樣品中含有轉基因作物成分。
[0027] 本發明方法可以直接對待檢測樣品的基因組中的轉基因玉米BT176進行定量檢 測，從而省去了現有的數字PCR方法中的樣品前處理步驟，使得檢測過程簡便易行，避免了 前處理步驟對檢測結果準確性的不良影響。另外，在本發明方法中，由于轉基因成分是通過 外源基因拷貝數與內參基因拷貝數的比例計算得到的，因此在同一個反應體系進行雙重檢 測可以提尚轉基因成分定量檢測的穩定性。
[0028] 利用本發明提供的雙重數字PCR熒光定量檢測方法和檢測試劑盒可以實現對轉 基因玉米BT176的絕對定量檢測，本方法定量檢測限可達到0. 5%，靈敏度可達到0. 1 %，能 夠滿足轉基因成分實際檢測的需要。此外，本方法操作簡單，靈活性強，是一種轉基因絕對 定量檢測的有效方法。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發明實施例2中轉基因玉米BT176外源基因引物探針與不同內參基 因引物探針組合的擴增效果圖；其中，A為與內參基因adhl-70bp組合，B為與內參基因 adhl-135bp組合，C為與內參基因hmga-79bp組合，D為與內參基因zssllb-88bp組合。 [0030]圖2為本發明實施例2中轉基因玉米BT176品系特異性檢測結果；其中，橫坐標為 不同轉基因玉米品系，縱坐標為利用雙重數字PCR法擴增得到的外源基因拷貝數。
【具體實施方式】
[0031] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0032] 實施例1用于轉基因玉米BT176雙重數字PCR熒光定量檢測的引物和探針組合的 設計
[0033] 根據轉基因玉米BT176品系外源基因插入序列及邊界序列設計了如下用于轉基 因玉米BT176雙重數字PCR熒光定量檢測的引物和探針組合（SeqIDNo. 1-6):
[0034]外源基因正向引物：5' -GGCCGTGAACGAGCTGTT-3'
[0035]外源基因反向引物：5' -GGGAAGAAGCCTACATGITITCTAA-3'
[0036]外源基因探針：5'-FAM-AGCAACCAGATCGGCCGACACC-BHQ1-3'
[0037] 內參基因adhl-135正向引物：5' -CGTCGITTCCCATCTCTTCCTCC-3'
[0038]內參基因adhl-135反向引物：5' -CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3'
[0039] 內參基因adhl-135探針：5' -VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-BHQ1-3'。
[0040] 實施例2轉基因玉米BT176雙重數字PCR定量檢測方法的建立
[0041] 1.1實驗材料
[0042] 本實施例中使用的轉基因玉米BT176樣品及其親本非轉基因樣品，轉基因玉米品 系NK603、M0N810、MIR604、MIR162、3272、M0N863均由中國檢驗檢疫科學研究院提供。PCR 芯片購自美國Fluidigm公司，型號為48. 770DigitalArrayChip;BioMarkHD高通量基 因分析系統（BiomarkHDSystem)購自Fluidigm公司。
[0043] 1. 2實驗用轉基因作物種子樣品基因組DNA提取
[0044] (1)將作物種子樣品研磨并徹底風干；
[0045] (2)將轉基因玉米品系與親本非轉基因種子樣品進行不同比例的混合，并通過混 勻儀器的過夜混勻得到實驗用的不同轉基因濃度的樣品；
[0046] (3)用分析天平稱取100mg樣品，加入400yLAPI緩沖液以及4yL的RNaseA， 劇烈震蕩混勻后，65°C下水浴20min，期間震蕩混勻2-3次；
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