豬肉質性狀相關基因Myo6的分子克隆及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于家畜分子生物學技術領域，涉及一種包含如SEQIDNO: 1所示豬基因 核苷酸的核酸分子。本發明還涉及如SEQIDNO: 1所示的My〇6基因的分子克隆方法及多 核苷酸序列中的單核苷酸多態性位點以及檢測所述單核苷酸多態性位點的方法。
【背景技術】
[0002] 豬肉是動物性蛋白的主要來源，隨著人們對肉需要量的增加，對肉質的要求也相 應提高。影響豬肉質的因素有遺傳和非遺傳的，豬肌內脂肪含量對肉質性狀有很大的影響， 一般來說，肌內脂肪含量越高，豬肉質越嫩，從而肉質越好。肉質性狀大多屬于數量性狀，由 微效多基因控制。許多肉質性狀只能在動物屠宰后才能測定，所以常規選育只能進行同胞 或半同胞測定，這樣必增加選育成本，且遺傳進展緩慢。豬基因組草圖的構建，使得尋找影 響肉質性狀的主基因或與其緊連鎖的分子標記成為可能，這些分子標記一經確認，就可進 行標記輔助選擇育種。利用分子標記進行輔助選擇（MAS)進行肉質性狀改良是一種有效的 途徑。
[0003]Myo6(Myosin6,肌球蛋白6)屬于肌球蛋白家族。肌球蛋白家族是一大類依賴ATP 的機械酶，存在于所有的真核細胞中，利用ATP水解產生的動力沿著肌動蛋白絲運動，其最 早被認識的生理作用是參與肌肉的收縮，而近年來發現眾多肌球蛋白在細胞運動、細胞分 裂，信號傳導等發揮重要的作用。參與肌肉收縮的雙極性肌絲的肌球蛋白被稱為常規肌球 蛋白；這些肌球蛋白沒有雙極性肌絲，也稱為非常規肌球蛋白，My〇6是非常規肌球蛋白基 因家族中的一員。
[0004] My〇6基因其多種功能而受到多種領域學者的關注，如在果蠅中發現它參與精子的 產生、非對稱細胞分裂中紡錘體的旋轉，而在哺乳動物細胞中，My〇6參與細胞的內吞作用、 高爾基體的維持，還和人類聽覺相關等等。
[0005] My〇6基因在進化中十分保守，在線蟲到人類的很多物種中均有表達，它位于人染 色體6ql3、小鼠染色體9E1、野雞3號染色體、豬1號染色體。目前國內外關于人類、鼠、果 蠅等的My〇6基因及其編碼蛋白的功能、調控機理都研究得比較深入。但是，關于豬My〇6基 因的研究報道很少。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于克隆豬My〇6基因cDNA分子，尋找My〇6基因的突變位點以及基 因多態性的檢測方法，為豬肉質性狀標記輔助育種提供一種有用的分子標記。
[0007] 本發明所要解決的技術問題是：針對上述現有技術的不足，提供一種豬肉質性狀 相關基因My〇6的分子克隆及應用，為豬肉質性狀標記輔助選擇提供有用的分子標記。
[0008] 為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案是：以人的Myo6基因序列（GenBank 收錄號為NC_000006. 12)為種子序列，在GenBank中利用BLASTN(BasicLocalAlignment SearchToolNucleotide)，參照其同源性在 80% 以上的豬EST(ExpressionSequence Tags)設計特異引物，利用RACE(RapidAmplificationofcDNAEnd)，克隆出豬Myo6 基因cDNA全長，該豬Myo6基因的DNA序列如SEQIDNO: 1所示。Myo6基因的多態性是利用比 較基因組學方法根據人的My〇6基因序列設計引物，以豬的基因組DNA為模板擴增，擴增片 段利用測序篩選SNP，并利用PCR-RFLP進行基因分型技術，發現第709bp處有一個G/A的 堿基突變，導致PCR-RFLP-XbaI多態性。
[0009] 試驗材料：25日齡沙子嶺豬由湖南省湘潭市沙子嶺豬資源場提供，取背最 長肌-80°C保存，5 '-RACEVersion2. 0 試劑盒購于Invitrogen公司，3 '-RACE SMARTer?RACEcDNAAmplificationKit試劑盒購于Clontech公司。
[0010] 總RNA提取與cDNA第1鏈的合成：用SUPERSCRIPTIIRT酶和引物GSP1對總RNA 進行基因第一鏈cDNA的合成，使用RNaseMix對合成的cDNA進行去RNA處理，最后對cDNA 進行純化。
[0011] 引物設計：據GenBank人Myo6基因（登錄號：NC_000006. 12)序列保守區設計引 物，引物設計的軟件為Premiere5. 0,引物設計的原則是特異性引物長度在23-28個核苷 酸，GC含量在50% -70%，退火溫度在65-70°C，使用巢式PCR進行擴增。
[0012] 編碼序列PCR擴增：以合成的豬cDNA為模板，在保守區設計引物經過克隆測序，獲 得該基因部分⑶S序列。
[0013] 5 ^ -RACE擴增：使用TdT酶和dCTP對純化后的cDNA末端加上多聚C，使用引物 GSP2(Gene_SpecificPrimers)和試劑盒中的橋連鉚釘引物AUAP(表1)對已經加dC尾的 cDNA進行PCR第一輪擴增；使用引物GSP3和試劑盒里中的橋連通用擴增引物AUAP進行巢 式PCR第二輪擴增，將第二輪PCR產物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化，純化后的 PCR產物與pMD18-T進行連接，轉化后對陽性克隆進行測序，獲得目的序列。
[0014] 3'-RACE擴增：使用引物 3' 452-1 和UPM(UniversalPrimerAMix)，以上面 合成的cDNA為模板進行第一輪PCR擴增。將第一輪PCR擴增產物稀釋50倍，然后用引物 3' 452-2和UPM(表1)進行第二輪PCR擴增。將第二輪PCR產物進行電泳并對目的條帶 進行切膠回收純化。純化后的PCR產物與pMDIST進行連接，轉化后挑取陽性克隆測序。
[0015] 將擴增得到的5' -RACE長度為526bp、3' -RACE擴增得到的長度2264bp和中間 序列拼接得My〇6基因的全長cDNA序列，從而完成本發明的My〇6基因的克隆的內容。
[0016] 表1本發明中使用的引物序列
[0017]
[0018] 以下為My〇6基因分子標記的篩選。
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[0019] DNA樣品：取小塊豬耳組織提取DNA，共6個品種：大白豬167頭，桃源黑豬58頭、 沙子嶺豬100頭、浦市鐵骨豬74頭，寧鄉豬196頭和大圍子豬228頭，共計823頭。
[0020] 引物設計：利用比較基因組學方法根據人的My〇6基因（GenBank收錄號為NC_000006. 12)的第11外顯子至第12外顯子之間，以該基因在GenBank作BLAST，序列比 對后篩選出候選SNPs位點，運用PCR-RFLP技術驗證該位點。
[0021] 制備了檢測上述序列表SEQIDN0:1基因片段突變的引物對，所述引物 對，正向引物為 5 ' -ACTACGGGAACTCCAACC-3 '(見SEQIDN0 :2)，反向引物為 5' -ACTTAACCAAATGCCACC-3，（見SEQIDN0:3)。
[0022] PCR條件：PCR反應體系（總體積 20yL) : 10XBuffer2yL、2mmol/LdNTPs 1.6 1^、20臟〇1/1]\%(：121.6 1^、了39 0嫩聚合酶（51]/1^)0.41^、0嫩模板（100即/ 1^)11^、上下游引物（10口111〇1/1^)各0.41^、及(1(111 20 12.6 1^。
[0023] 反應程序：94°C預變性7min;94°C變性45s，59°C退火30s，72°C延伸45s，共30個 循環；72°C后延伸7min，最后4°C保存。
[0024] 取10yLPCR擴增產物，加2yL溴酚藍上樣緩沖液混勻后，點樣于2%的瓊脂糖凝 膠（含 0. 05%EB)上，然后點 6yL100bpDNAMarkers作為參照。5V/cm電泳 0. 5-1.Oh。 電泳結束后在凝膠成像系統中觀察擴增結果并拍照，結果如圖1所示。將純化后的PCR產 物后送鉑尚生物技術公司測序。
[0025] PCR產物的XbaI酶切：
[0026] 在10yLPCR產物中加入0.8yL10X內切酶緩沖液、0.2yL限制性內切酶和 1yL雙蒸水，總體積為12yL，37°C消化4-10h。A/G位點用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，5V/ cm電壓電泳0.5h，紫外燈下觀察結果并拍照，酶切結果如圖2,擴增產物進行測序，序列 如SEQIDN0 :1所