獼猴桃AdADH2基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物基因工程領域，具體涉及獼猴桃AdADH2基因與應用。
【背景技術】
[0002] 獼猴桃屬于獼猴桃科（Actinidiaceae)獼猴桃屬（Actinidia)落葉性藤本果樹， 全世界獼猴桃屬植物有54個種21個變種，共約75個分類單位，種質資源極其豐富。1904 年，新西蘭從我國引種獼猴桃，人工馴化，開始品種選育工作和商業化生產。目前市場上栽 培的主要品種大多選自于美味獼猴桃和中華獼猴桃，還有少量選自軟棗獼猴桃。獼猴桃由 于含有極其豐富的營養價值，尤其是Vc含量很高，被譽為"Vc之王"，所以越來越受到人們 的青睞。
[0003] 江蘇省夏季雨季較長，雨水較多，給獼猴桃生長生產帶來了嚴峻的挑戰。2011年， 由于雨季雨水較多，澇害嚴重，揚州市大量成年獼猴桃植株死亡，給果農造成了巨大的經濟 損失。因此，獼猴桃的耐澇問題是制約江蘇省獼猴桃產業發展的主要因素之一。選育耐澇 性砧木和品種資源無疑是解決該問題的主要途徑。隨著分子生物學及基因工程技術在果樹 領域的應用，應用基因工程技術手段來改造獼猴桃的抗性，是今后抗性研究的目標。因此， 挖掘和研究獼猴桃耐澇基因將會為通過基因工程技術手段培育獼猴桃耐澇性砧木和品種 資源奠定理論基礎。
[0004]目前，有關植物耐澇基因篩選方面的研究較少，關于耐澇基因的表達與調控方面 的研究更是微乎其微。獼猴桃品種'金魁'是我國選育的美味獼猴桃品種之一，抗旱、耐澇、 抗凍能力較強。在獼猴桃耐澇基因挖掘方面的研究還未見報道。因此克隆和研究獼猴桃抗 逆相關基因，對于開發具有中國自主知識產權的果樹抗逆基因具有重要的意義。
【發明內容】
[0005] 發明目的：
[0006] 本發明的目的是提供獼猴桃AdADH2。
[0007] 本發明的另一目的是提供該獼猴桃AdADH2的編碼基因。
[0008] 本發明的又一目的是提供該基因的功能。
[0009] 本發明的目的可通過如下技術方案實現：
[0010] 本發明所提供的獼猴桃AdADH2,來源于獼猴桃優良品種'金魁'，氨基酸序列如SEQ IDN0. 2 所示。
[0011] 本發明所述的獼猴桃AdADH2的編碼基因，其cDNA序列如SEQIDNO. 1所示，含有 1143bp的最大開放閱讀框，編碼SEQIDNO. 2所示的380個氨基酸殘基序列。
[0012] 含有本發明AdADH2基因的表達載體。
[0013] 所述的表達載體優選將所述的獼猴桃AdADH2的編碼基因插入到pCAMBIA1301載 體的KpnI和SacI酶切位點間所得。
[0014] 宿主菌是指將含有本發明AdADH2基因的表達載體轉入的根癌農桿菌EHA105.
[0015] 擴增AdADH2cDNA全長的引物為：
[0016] AdADH2-0RFsense:5'-CATAGAGTTCTGTTTTCAGTGAAG-3'
[0017]AdADH2-0RFantisense:5'-TGAAAAGTATTGTAGGCAGATTAC-3'
[0018] 實時熒光定量RT-PCR分析中涉及的AdADH2的qPCR引物為：
[0019] AdADH2-qPCRsense:5,-CTGAAATGACCAGCGGAGGAG-3'
[0020] AdADH2-qPCRantisense:5'-TGTCTTGAATACGGCATCTTTGTG-3'
[0021] 上述獼猴桃AdADH2、其編碼基因、含有編碼基因的表達載體、宿主菌在培育耐澇或 耐鹽植物中的應用。
[0022] 有益效果：
[0023] 本發明在金魁獼猴桃中克隆到一個AdADH2基因，AdADH2參與獼猴桃耐澇和耐鹽 脅迫過程。
[0024]AdADH2編碼基因在澇害脅迫、低溫脅迫、和鹽害脅迫誘導條件下表達。轉基因擬南 芥中過量表達AdADH2編碼基因，與對照組相比，轉基因材料表現耐澇、耐鹽的特性。這一結 果說明AdADH2基因參與植物抵抗澇害或鹽害脅迫過程中起著非常重要的作用。
[0025] 本發明的AdADH2對于培育耐澇或耐鹽植物品種或植物改良品種具有重要意義， 在作物育種方面具有廣泛的應用前景。
[0026] 利用本發明的植物表達載體，將AdADH2基因導入植物體內，可以獲得耐澇和耐鹽 的轉基因植株。
【附圖說明】
[0027] 圖1AdADH2基因在獼猴桃澇害（A)、低溫⑶和高鹽（C)脅迫下的表達特性
[0028] 圖2轉基因擬南芥與野生型擬南芥在澇害脅迫處理條件下的表型觀察
[0029]ADH2-3 :轉基因擬南芥株系；WT:野生型株系；A:處理前表型；B:澇害處理2周后 表型；C:恢復生長1周后表型。
[0030] 圖3轉基因擬南芥與野生型擬南芥在澇害脅迫處理后恢復生長1周后的根長（A)、 鮮重（B)和干重（C)的統計分析
[0031]ADH2-3 :轉基因擬南芥株系；WT:野生型株系；
[0032]圖4轉基因擬南芥與野生型擬南芥在鹽脅迫處理條件下的發芽情況分析
[0033]ADH2-3 :轉基因擬南芥株系；WT:野生型株系；
[0034] 圖5轉基因擬南芥與野生型擬南芥在鹽脅迫處理條件下的發芽率統計分析
[0035]ADH2-3 :轉基因擬南芥株系；WT:野生型株系；
【具體實施方式】
[0036] 下列實例中所有的方法無特別說明，均為常規方法
[0037] 實施例1獼猴桃AdADH2基因的克隆與鑒定
[0038] 實驗材料為獼猴桃品種'金魁'扦插苗，對其進行澇害處理0天，1天，2天，4天 后，取其根部組織，參考蔡斌華等改進的CTAB法（蔡斌華，張計育，高志紅，渠慎春，佟兆國， 靡林，喬玉山，章鎮.一種改良的提取草莓屬葉片總RNA的方法[J].江蘇農業學報，2008， 24(6) :875-877)提取RNA，反轉錄cDNA。根據已經報道物種的序列，在ADH2最大開放閱 讀框兩端分別設計引物AdADH2-0RFsense:5' -CATAGAGITCTGTITTCAGTGAAG-3'（SEQID N0.3)和AdADH2-0RFantisense:5'-TGAAAAGTAITGTAGGCAGATTAC-3'（SEQIDN0.4)。以 cDNA為模板，進行PCR，反應條件為：94°C5min熱變性；94°C45s，58°C45s，72°C90s，共 35 個循環；72°C延伸15min。將PCR產物用膠回收試劑盒（Genscript)回收后，與pMD19-T載 體（Takara,Japan)連接，然后轉化大腸菌DH5a，挑選陽性克隆，進行測序。測序得到的片 段長度為1221bp(SEQIDNO. 5)，含有1143bp的最大開放閱讀框（SEQIDNO. 1)，編碼380 個氨基酸殘基序列（SEQIDNO. 2)。
[0039] 實施例2獼猴桃AdADH2基因在澇害、低溫和高鹽脅迫條件下的表達特性
[0040] 以獼猴桃品種'金魁'為材料，對其進行澇害、低溫（4°C)、高鹽（200mMNaCl) 處理，處理后取其葉片，提取RNA，cDNA的合成用能消除