灰霉醌a和b及其制備方法和醫藥用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬醫藥領域，涉及具有生物活性的新海洋天然產物灰霉醌A (81：代口1：0&111：11抑911；[110116 4)和灰霉醌13(81^6口1：0&111：11抑911；[110116 13)及其制備方法，以及在 制備抗腫瘤藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤（癌癥）對人類的健康和生命危害嚴重，為當今世界死亡率最高的疾病， 也是我國城鄉居民的第一死因。化療是目前世界上腫瘤手術切除后藥物治療的主要方法， 但化療毒性較大，而且療效有限。雖然分子靶向藥物為癌癥的治療開辟了新途徑，但其臨床 療效并未達到預期效果，而且癌細胞對抗腫瘤藥物耐藥性的不斷增加也嚴重影響現有藥物 的療效。顯然，臨床上需要研究開發結構新穎、療效好和安全性高的新型抗腫瘤藥物。天然 產物，特別是海洋天然產物是新型抗腫瘤藥物研究開發的資源寶庫。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供從海洋沉積物中分離具有抗膠質瘤活性的放線菌菌株 P82SMLY，所述的菌株分類命名為灰色鏈霉菌P82SMLYP82SMLY)， 已被中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號CCTCCNO:M2015386,保藏日2015. 6. 19,保 藏地址：中國武漢。
[0004] 所述的菌株為放線菌灰色鏈霉菌P82SMLY,通過以下步 驟分離培養而獲得： (1)灰色鏈霉菌發riseiA?P82SMLY的分離培養 取空氣干燥的海洋沉積物用液體菌種培養液稀釋，稀釋后的濃度為0. 1-0. 001g/mL， 取一定量的樣品稀釋液均勻分散到含有固體培養基的培養皿中，在室溫條件下培養一定時 間后，將不同的菌落分別轉移到另一含有固體培養基的培養皿中，在室溫條件下繼續培養 一定時間。最后將生長良好的單一菌落（P82SMLY)接種到斜面培養基培養后置于4°C冰箱 保存備用。
[0005] 所述的海洋沉積物是從浙江舟山東海海域中獲得；所述的液體菌種培養液每100 mL的組成為：1. 5克葡萄糖、1. 5克丙三醇、1. 5克麥芽提取物、2. 5克酵母提取物、0. 5克 酪蛋白氨基酸和〇. 1克碳酸鈣，或是適宜菌株P82SMLY生長的其它組成的液體培養基； 所述的樣品稀釋液的取樣量為100-300uL;所述培養皿所含的固體培養基為細菌瓊脂 (Bacto-agar)培養基或其它固體培養基；所述的斜面培養基為高氏合成斜面培養基或其 它固體斜面培養基；所述的室溫培養溫度為20-30°C;所述的培養時間為7-15天。
[0006] (2)灰色鏈霉菌 發riseiA?P82SMLY的菌種鑒定 上述步驟（1)分離培養所得的菌株用目前實驗室普遍使用的16SrDNA序列分析方 法鑒定菌株P8 2SMLY的種類，確定為灰色鏈霉菌，分類命名為topees P82SMLY，已被中國典型培養物保藏中心保藏-中國武漢武漢大學，保藏編號CCTCCNO:M 2015386。
[0007] 本發明的第二個目的是提供兩種具有抗膠質瘤活性的海洋天然產物灰霉醌A (81：代口1：0&111：11抑911；[110116厶，1)和灰霉醌13(81：代口1：0&111：11抑911；[110116 13，2)，所述的灰霉醌 A和灰霉醌B為新化合物，它們的化學結構式為：
本發明的第三個目的是提供灰霉醌A和灰霉醌B的制備方法，由海洋放線菌灰色鏈霉 菌P82SMLY產生，通過以下步驟實現： (1)灰霉醌A和灰霉醌B產生菌灰色鏈霉菌P82SMLY發酵菌 液的制備 取灰色鏈霉菌P82SMLY的菌落接種到含有一定量的液體菌種 培養基的大三角燒瓶中，將含有P82SMLY菌種的培養液在室溫條件下旋轉振搖培養一定時 間后以制備菌種液。最后將菌種液轉入含有一定量的液體發酵培養基的大三角燒瓶，在室 溫條件下旋轉振搖發酵培養一定時間后，得到具有抗菌活性的P82SMLY發酵菌液。
[0008] 所述的液體菌種培養基每1000mL的配方為：20. 0克淀粉、1. 0克硝酸鉀、0. 5克 磷酸氫二鉀、〇. 5克硫酸鎂、0. 5克氯化鈉和0. 01克硫酸鐵，所用量為150-300mL;所述的液 體發酵培養基為液體高氏合成培養基，所用量為250-500mL;所述的大三角培養瓶為500 或1000mL;所述的室溫培養溫度為20-30°C;所述的旋轉振搖的旋轉速度為160-200rpm; 所述的培養時間為5-15天。
[0009] (2)灰霉醌A和灰霉醌B的提取分離純化 菌株P82SMLY的發酵菌液用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物，然后用十八烷基硅烷 鍵合硅膠（0DS)柱層析分離，分別用70%、85%和100%的甲醇洗脫，得到三個組分。組分3 繼續用高效液相（HPLC)分離，得到灰霉醌A和灰霉醌B。
[0010] 所述柱層析的0DS用量與上量的樣品量比例是40-60g:1. 0g;所述的高效液相 分離條件是：Agilent1260高效液相色譜儀，Agilent1260DAD檢測器，AgilentZorbax SB-Cls色譜柱（250滅9.4mm，5鍵〇,甲醇/水（85/15)為流動相，柱溫26T：，檢測波 長 238nm，流速為 1. 0mL/min。
[0011] (3)灰霉醌A和灰霉醌B的結構鑒定 灰霉醌A和灰霉醌B的結構是根據它們的紫外光譜、一維和二維的NMR光譜和高分辨 質譜數據而鑒定。
[0012] 本發明的第四個目的是提供灰霉醌A和灰霉醌B在制備治療腦膠質瘤藥物中的應 用。所述的灰霉醌A和灰霉醌B可顯著抑制多種腦膠質瘤細胞的增殖，顯著誘導腦膠質瘤 細胞的凋亡。
[0013] 所述藥物為灰霉醌A或灰霉醌B活性成分單獨，或灰霉醌A和灰霉醌B兩者合用， 或灰霉醌A和灰霉醌B與其它藥物或與有效成分一起，與藥學上可接受的載體組成的藥物。 所述藥物的制劑形式為：液體制劑、固體制劑、膠囊制劑、緩釋制劑、納米制劑。
[0014] 本發明從海洋沉積物中分離培養到活性物質產生菌灰色鏈霉菌 P82SMLY,并從該菌株的培養液中發現了兩個新的生物活性物質灰霉醌A (streptoanthraquinoneA)和灰霉醌B(streptoanthraquinoneB)。灰霉醌A和灰霉醌B 顯著抑制多種腦膠質瘤細胞增殖，并可顯著誘導腦膠質瘤細胞凋亡，所以，灰霉醌A和灰霉 醌B在制備治療腦膠質瘤藥物方面具有好的應用前景。
【附圖說明】
[0015]圖 1.灰霉醌A(StreptoanthraquinoneA, 1)的紫外圖譜。
[0016]圖 2.灰霉醌A(StreptoanthraquinoneA, 1)的氫譜。
[0017] 圖 3.灰霉醌A(StreptoanthraquinoneA, 1)的碳譜。
[0018]圖 4 和圖 5.灰霉醌A(StreptoanthraquinoneA, 1)的1H-1!!COSY譜。
[0019] 圖 6_8.灰霉醌A(StreptoanthraquinoneA, 1)的HSQC譜。
[0020] 圖 9_13.灰霉醌A(StreptoanthraquinoneA, 1)的HMBC譜。
[0021] 圖 14.灰霉醌 A(StreptoanthraquinoneA, 1)的HRESIMS譜。
[0022] 圖 15.灰霉醌 B(StreptoanthraquinoneB, 2)的紫外圖譜。
[0023]圖 16.灰霉醌 B(StreptoanthraquinoneB, 2)的氫譜。
[0024]圖 1L 灰霉醌 B(StreptoanthraquinoneB, 2)的碳譜。
[0025] 圖 18_2〇.灰霉醌B(StreptoanthraquinoneB, 2)的1HJHCOSY譜。
[0026] 圖 21.灰霉醌 B(StreptoanthraquinoneB, 2)的HSQC譜。
[0027] 圖 22_25.灰霉醌B(StreptoanthraquinoneB, 2)的HMBC譜。
[0028] 圖 26.灰霉醌 B(StreptoanthraquinoneB, 2)的N0ESY譜。
[0029] 圖 27.灰霉醌 B(StreptoanthraquinoneB, 2)的HRESIMS譜。
[0030] 圖28.灰霉醌A(1)和灰霉醌B(2)主要的COSY、HMBC和N0E相關性。
[0031] 圖29.灰霉醌A抑制膠質瘤細胞的活性。
[0032] 圖30.灰霉醌B抑制膠質瘤細胞的活性。
[0033] 圖31.灰霉醌A和B誘導腦膠質瘤細胞凋亡。
【具體實施方式】
[0034] 以下結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細描述，但本發明不限于這些實 施例。
[0035] 灰霉醌A和灰霉醌B產生菌灰色鏈霉菌P82SMLY的分離 培養 取空氣干燥的海洋沉積物3克用液體菌種培養液稀釋到濃度為0.01g/mL。液體菌種 培養基每100mL的組成為：1. 5克葡萄糖、1. 5克丙三醇、1. 5克麥芽提取物、2. 5克酵母提 取物、0. 5克酪蛋白氨基酸和0. 1克碳酸鈣。取200uL的樣品稀釋液均勻分散到含有細菌 瓊脂（Bacto-agar)固體培養基的培養皿中，在室溫條件下培養10天后，將不同的菌落分 別轉移到另一含有細菌瓊脂（Bacto-agar)固體培養基的培養皿中，在室溫條件下繼續培 養7天。最后將生長良好的單一菌落（P82SMLY)接種到高氏合成斜面培養基，置于4°C冰箱 保存備用。
[0036] 灰霉醌A和灰霉醌B產生菌灰色鏈霉菌P82SMLY的菌種 鑒定 使用16SrDNA序列分析方法鑒定所獲得菌株P82SMLY的種類。
[0037] 2. 1實驗試劑及儀器 PCR試劑：EXTaq酶（TaKaRa)，dNTP(TaKaRa)，引物（Invitrogen合成），引物序列 是：TACGGYTACCTTGTTACGACTT和AGAGTTTGATCMTGGCTCAG Marker：DL5000 實驗儀器：離心機，電泳儀，PCR儀，ABI3730XL測序儀。
[0038] 2.2實驗步驟 細菌基因組DNA抽提 電泳檢測 PCR擴增 a. PCR反應體系
b. PCR反應條件
c. 電泳檢測 d. 測序：切膠純化測序 e. 分析結果：拼接序列。
[0039] 2.3實驗結果
以上獲得的16SrDNA序列與美國NIH的NCBIGenBank數據庫比較，其結果表明：菌 株P82SMLY的 16SrDNA序列與GenBank庫中的 5^_/16>/^咖尺6>6發riseiA?strainCB00830 的16SrDNA序列有100%的相似性（登錄號：KF9817 31. 1)。因此，本發明所獲得的海 洋菌株P8 2SMLY分類命名為灰色鏈霉菌P8 2SMLY。灰色鏈霉菌 (Stre/7topeesP82SMLY