沃格瑪木霉產菌絲培養基及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物培養領域，更具體地，涉及沃格瑪木霉產菌絲培養基及其制備 方法與應用。
【背景技術】
[0002] 木霉屬（Trichoderma)真菌種類很多，分布廣泛，是一類重要的生物資源，部分種 類在許多領域發揮著重要作用，具有良好的經濟價值和應用前景，因而備受關注。
[0003] 2005年，沃格瑪木霉（Trichodermavoglmayrii)首次報道于奧地利，2014年本專 利申請的發明人首次發現該種在中國分布，并篩選證明了沃格瑪木霉P-T8196菌株對多 種植物病原真菌（以下簡稱植病菌）均具有一定的生防潛力。但是，該菌株在PDA、CMD、SNA 等多種培養基上生長緩慢，菌落稀疏，缺乏氣生菌絲，產孢所需時間長，量少，嚴重影響和阻 礙該菌株生防潛能的發揮和進一步利用。國內外鮮有對該菌人工培養條件的研究報道，適 宜該菌生長的培養條件不清楚，因此明確適宜沃格瑪木霉生長的培養條件，將為后續生理 學、化學和菌株利用等方面的研究奠定基礎。
【發明內容】
[0004] 本發明提供了沃格瑪木霉培養基及其制備方法與應用，解決了沃格瑪木霉在其他 培養基中生長緩慢、氣生菌絲少、產孢少且時間長的問題。
[0005] 本發明的一個方面，提供一種沃格瑪木霉產菌絲培養基，具體成分及含量如下： 糊精20 - 60g，蛋白胨10 - 30g，酵母粉1 - 5g，硫酸鎂0. 5 - 4. 5g，磷酸二氫鉀0. 6 -lg，水 1000mL，pH自然。
[0006] 本發明的另一個方面，提供以上所述培養基的制備方法，包括如下步驟：
[0007] 將糊精、蛋白胨和酵母粉按照所需終濃度配制溶液；
[0008] 將硫酸鎂和磷酸二氫鉀配制成母液；
[0009] 對上述成分進行滅菌，其中，糊精、蛋白胨和酵母粉配制的溶液采用高壓蒸汽滅 菌，硫酸鎂和磷酸二氫鉀采用過濾滅菌；
[0010] 按照所需終濃度定量，混配均勻。
[0011] 本發明的再一個方面，提供一種促進沃格瑪木霉產菌絲的培養方法，包括如下步 驟：
[0012] 將沃格瑪木霉接種于PDA培養基進行活化培養；
[0013] 然后取活化培養后的沃格瑪木霉菌塊，接種于PDB培養基中培養，制備接種液；
[0014] 按1X107/mL孢子的接種量，將沃格瑪木霉的接種液接種于以上所述的本發明的 培養基中，置于轉速160rpm，溫度28°C，黑暗條件下培養，6 - 7天達到發酵終點。
[0015] 以上所述的培養方法中，活化培養條件為25°C培養3天。
[0016] 以上所述的培養方法中，接種液的制備條件為在轉速160rpm，溫度28°C，黑暗條 件下培養5天。
[0017] 本發明提供的培養基組成成分明確，簡單，易配制，成本較低，利用該培養基發酵 生產沃格瑪木霉菌具有工藝簡單，菌體生長速度快，菌絲產量高等優點，同時該培養基中的 碳氮源均未引入農副產品，使代謝產物更容易分離提取，既適于該菌的理論研究，也適于工 業化發酵生產。
【具體實施方式】
[0018] 以下實施例對本發明的【具體實施方式】進行更加詳細的說明，以便能夠更好地理解 本發明的方案以及其各個方面的優點。然而，以下描述的【具體實施方式】和實施例僅是說明 的目的，而不是對本發明的限制。
[0019] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0020] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0021] 實施例1利用產菌絲培養基發酵生產沃格瑪木霉菌絲體
[0022] 沃格瑪木霉產菌絲培養基配方為：糊精50g，蛋白胨21g，酵母粉2. 9g，硫酸鎂 2. 3g，磷酸二氫鉀0. 9g，加水定容至1000mL，pH自然。
[0023] 對照培養基 1(GaoHJ，ChuX，WangYW,ZhouF,ZhaoK，MuZM,LiuQX. 2013. MediaoptimizationforlaccaseproductionbyTrichodermaharzianumZF-2using responsesurfacemethodology.J.Microbiol.Biotechnol. 23:1757 - 1764.):葡萄糖 20g，硫酸銨lg，磷酸二氫鉀0. 6g，硫酸鎂lg，加水定容至1000mL，pH自然。
[0024] 對照培養基2 :土豆200g，葡萄糖20g，加水定容至1000mL，pH自然。
[0025] 將沃格瑪木霉菌株（Trichodermavoglmayrii)P_T8196 (本專利申請的發明人分 離并已于2015年8月24日保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No. 11207。保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。）接種于馬鈴薯葡萄糖固體 培養基（PDA)上活化，25°C培養3天，然后用打孔器在菌落邊緣取直徑為5_的菌塊8個， 接種于馬鈴薯葡萄糖培養基（PDB)中，裝液量100mL(250mL三角瓶），置于轉速160rpm，溫 度28°C，黑暗條件下培養5天，制備接種液。
[0026] 按照1X107/mL孢子的接種量，將沃格瑪木霉接種于上述3種培養基中，裝液量 100mL(250mL三角瓶），置于轉速160rpm，溫度28°C，黑暗條件下培養，6天后，用直徑為 12. 5cm的中速定性濾紙（已烘干稱重）過濾發酵產物，并用100mL蒸餾水洗滌3次，然后將 過濾完畢的濾紙及菌絲體置于80°C培養箱內烘干至菌體恒重。結果顯示，本發明培養基、對 照培養基1、對照培養基2培養的菌絲體產量分別為26. 9g/L、7. 08g/L、2. 45g/L，差異顯著。 本發明培養基的菌絲產量明顯高于對照培養基1和對照培養基2的菌絲產量。
[0027] 產物驗證：采用CTAB法對發酵所得的沃格瑪木霉菌絲體進行基因組DNA提取，對 其ITS(核糖體轉錄間隔區）進行PCR擴增（所用引物為ITS4和ITS5組成的引物對）并 測序，將測序結果提交GenBank進行Blast分析。引物序列如下：
[0028] ITS4 :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'
[0029] ITS5 :5, -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- 3，
[0030]測序結果詳見序列表的序列1(SEQIDN0 :1)，分析發現其與GenBank中 Trichodermavoglmayrii(沃格瑪木霉）的CPK948、CPK1592兩個菌株的同源性高達100%， 與CPK95UCPK941兩個菌株的同源性達99%，可確定利用本發明提供的產菌絲培養基發酵 得到的產物為沃格瑪木霉的菌絲體。
[0031] 實施例2利用產菌絲培養基發酵生產沃格瑪木霉菌絲體
[0032] 沃格瑪木霉產菌絲培養基配方為：糊精40g，蛋白胨20g，酵母粉3g，硫酸鎂lg，磷 酸二氫鉀〇. 8g，加水定容至1000mL，pH自然。
[0033] 對照培養基1(Gaoetal. 2013):葡萄糖20g，硫酸銨lg，磷酸二氫鉀0? 6g，硫酸鎂 lg，加水定容至l〇〇〇mL，pH自然。
[0034] 對照培養基2 :土豆200g，葡萄糖20g，加水定容至1000mL，pH自然。
[0035] 將沃格瑪木霉菌株P-T8196 (本專利申請的發明人分離并保存）接種于馬鈴薯葡 萄糖固體培養基（PDA)上活化，25°C培養3天，然后用打孔器在菌落邊緣取直徑為5mm的 菌塊8個，接種于馬鈴薯葡萄糖培養基（PDB)中，裝液量100mL(250mL三角瓶），置于轉速 160rpm，溫度28°C，黑暗條件下培養5天，制備接種液。
[0036] 按照1X107/mL孢子的接種量，將沃格瑪木霉接種于上述3種培養基中，裝液量 100mL(250mL三角瓶），置于轉速160rpm，溫度28°C，黑暗條件下培養，6天后，用直徑為 12. 5cm的中速定性濾紙（已烘干稱重）過濾發酵產物，并用100mL蒸餾水洗滌3次，然后將 過濾完畢的濾紙及菌絲體置于80°C培養箱內烘干至菌體恒重。結果顯示，本發明培養基、對 照培養基1、對照培養基2培養的菌絲體產量分別為26. 0g/L、7. 08g/L、2. 45g/L，差異顯著。 本發明培養基的菌絲產量明顯高于對照培養基1和對照培養基2的菌絲產量。
[0037] 采用CTAB法對發酵所得的沃格瑪木霉菌絲體進行基因組DNA提取，對其ITS(核 糖體轉錄間隔區）進行PCR擴增（所用引物為ITS4和ITS5組成的引物對）