一種新型融合蛋白、藥物組合物及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種融合蛋白，具體涉及的是一種抑制腫瘤生長的新型融合蛋白及藥 物組合物及該新型融合蛋白的制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 免疫逃逸是腫瘤的惡化進程中非常重要的一步。腫瘤細胞通過避免人體免疫系 統的殺傷作用得以快速生長，從而促進癌癥的發生。T細胞表面重要的負調節分子ro-i、 CTLA-4和HM-3均能夠抑制癌癥發生過程中T細胞的免疫殺傷作用。目前，臨床上已有針 對H)-l和CTLA-4靶點的藥物，這些藥物在臨床上治療效果非常顯著。
[0003] 程序細胞死亡1 (PD-1)受體主要在激活的T細胞和B細胞中表達，其主要功能是 抑制免疫系統細胞的激活，這也是免疫系統一種正常的自穩機制，因過度的T/B細胞激活 會引起自身免疫病，所以ro-i是我們人體的一道護身符。在病理情況下，腫瘤微環境會誘 導浸潤的T細胞高表達ro-i分子，腫瘤細胞會高表達ro-i的配體ro-Li和ro-L2,導致腫 瘤微環境中ro-i信號通路持續激活，t細胞功能被抑制，無法殺傷腫瘤細胞，從而導致癌癥 的產生。阻斷這一信號通路的ro-i抗體可部分恢復t細胞的功能，使t細胞能夠繼續殺傷 腫瘤細胞。目前針對ro-l的抗體已有兩個藥物上市，分別是Nivolumab和Pembrolizumab， 二者在臨床上對多種癌癥均表現出顯著的治療效果。
[0004]VEGF-A是腫瘤細胞表達的一類促血管新生的生成因子，它的主要作用是提供免 疫抑制的微環境，為腫瘤細胞的增殖和癌癥的發生創造有利條件。科學家MagaliTerme (MagaliT，ThibaultV，etal, 2015,J.Exp.Med. 212:139-148)研究發現VEGF-A營造 的腫瘤微環境能夠引起CD8+T細胞表面H)-l分子的上調，從而引起CD8+T細胞的免疫殺傷 作用降低。同時發現VEGF-A的刺激能夠引起HM-3,CTLA-4,LAG-3等抑制分子的表達。
[0005] 現有技術中已有利用VEGF-A抗體和H)-l抗體作用治療腫瘤的報道，臨床應用中 常常是單獨使用其中一種抗體或同時使用兩種抗體對腫瘤進行治療，當同時采用上述兩種 抗體進行治療時則需要每天多次注射給藥，不僅給操作者帶來不便，而且給受試者也帶來 更多痛苦。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于克服現有技術中VEGF-Trap和H)-l抗體在臨床應用中需要每 天多次注射給藥的問題，提供既具有VEGF TRAP和H)-l抗體生理活性，又具有長效功能的 一種新型融合蛋白，并公開了該新型融合蛋白組成的藥物組合物及該新型融合蛋白的制備 方法和用途。
[0007] 為達到上述目的，本發明的技術方案如下： 一種新型的融合蛋白，其結構通式如下： X-連接肽-Y-連接肽-IgGFc片段或Y-連接肽-X-連接肽-IgGFc片段； 其中，X為VEGF-Trap及其衍生物；Y為H)-l抗體片段及其衍生物或者H)-l拮抗劑片 段及其衍生物。
[0008] 本發明并不是簡單的將兩種抗體蛋白混合，而是采用兩種抗體進行融合后組成一 種新型的融合蛋白，該蛋白能同時抑制H)-l和VEGF-A的活性，從而既能抑制腫瘤血管的新 生，又能雙重抑制ro-1的產生和活性，多條途徑激活t細胞；其具有既能饑餓腫瘤細胞，又 能激活T細胞殺傷腫瘤細胞的效果。
[0009] 本發明對單獨使用ro-1抗體和VEGF-A抗體，組合使用ro-1抗體和VEGF-A抗體， 以及使用H)-l抗體和VEGF-A抗體結合的融合蛋白VNI的效果進行小鼠內腫瘤生長情況檢 測，檢測結果如表7和圖3所示。通過表7可知：采用本發明的新型融合蛋白，其不僅僅能 同時具有兩種抗體分別饑餓腫瘤細胞、以及激活T細胞殺傷腫瘤細胞的功能，而且還能達 到兩種功能的協同促進作用，使抑制腫瘤生長的功能更加顯著；并且，通過圖3所示，采用 本發明的新型融合蛋白還具有有效延長各抗體單元生理活性功能效果的作用。
[0010] 優選地，所述連接肽為式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n所示的氨基酸序列，該n是 1~4的整數。所述X的氨基酸序列為SEQIDN0 :1或SEQIDN0 :3,或其核苷酸編碼序列 為SEQIDN0 :2 或SEQIDN0 :4。所述Y的氨基酸序列為SEQIDN0 :5 或SEQIDN0 :7， 或其核苷酸編碼序列為SEQIDN0:6或SEQIDN0:8。所述IgGFc片段為IgGlFc片段、 IgG2Fc片段、IgG3Fc片段或IgG4Fc片段，其氨基酸序列分別為SEQIDN0:9、ll、13、15， 或其核苷酸編碼序列分別為SEQIDNO:10、12、14、16。
[0011] -種制備新型融合蛋白的方法，將權利要求1-6任一項所述新型融合蛋白的編碼 核苷酸序列插入表達載體中，并將此表達載體引入相應的表達系統進而進行融合蛋白的表 達。本發明融合蛋白的表達載體可以是重組真核表達載體，優選哺乳動物細胞表達載體；也 可以是重組病毒表達載體，優選腺相關病毒或腺病毒載體。
[0012] 上述表達系統中融合蛋白的宿主細胞，可以為CH0細胞及其亞系或293細胞及其 亞系。
[0013] -種藥物組合物，由權利要求1-6任一項所述的新型融合蛋白與藥學上可接受的 載體或賦形劑組成。
[0014] 進一步，所述藥物組合物的制劑形式為注射劑、注射用凍干粉針。
[0015] -種新型融合蛋白的用途，所述權利要求1-6任一項所述的新型融合蛋白用于腫 瘤的治療；所述腫瘤為黑色素瘤、肺癌、肝癌、淋巴瘤、結腸癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸 癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌中的一 種或多種。
[0016] 本發明與現有技術相比，具有以下優點及有益效果： 1、 本發明的融合蛋白不僅能同時具有兩種抗體分別饑餓腫瘤細胞、以及激活T細胞殺 傷腫瘤細胞的功能，而且還能達到兩種功能的協同促進作用，使抑制腫瘤生長的功能更加 顯著； 2、 本發明的新型融合蛋白能有效延長各抗體單元生理活性功能效果，進而減少一個療 程的總用藥量，減少用藥成本； 3、 本發明可有效減少注射給藥的次數，減輕給藥痛苦。
【附圖說明】
[0017] 圖1為VNI對HUVEC細胞增殖影響的EC50值曲線示意圖。
[0018] 圖2為VNI刺激PBMC產生IFNy的曲線示意圖。
[0019] 圖3為鼠源VNI在體內抑制腫瘤生長的對比情況示意圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例，對本發明作進一步地詳細說明，但本發明的實施方式不限于此。
[0021] 實施例1蛋白制備 一種新型融合蛋白，其結構通式如下： X-連接肽-Y-連接肽-IgG Fc片段；其中，X為VEGF-Trap及其衍生物；Y為H)-l抗體 片段及其衍生物或者ro-i拮抗劑片段及其衍生物。
[0022] 本實施例中該X為VEGF-Trap，其核苷酸序列如SEQIDN0 :4所示；Y為H)-l抗體 片段，其核苷酸序列如SEQIDN0 :6所示；所述連接肽為式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n所示 的氨基酸序列，該連接肽中n為3;IgGFc片段的核苷酸序列如SEQIDN0:16所示；S卩，本 實施例中合成融合蛋白的基因片段核苷酸序列如SEQIDN0 :18所示。
[0023] 本實施例中上述新型融合蛋白的具體合成路線如下： 1.構建重組質粒 1. 1按照X-連接肽-Y-連接肽-IgGFc片段或Y-連接肽-X-連接肽-IgGFc片段的 通式，得到合成融合蛋白的基因片段和引物，并將合成融合蛋白的基因片段和引物重組至 質粒載體puc57中獲得puc57-VNI質粒。該合成融合蛋白的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO :13所示，該基因和引物由專業公司北京金唯智公司合成。
[0024] 1. 2將puc57-VNI質粒和pCHOl. 0質粒分別進行雙酶切處理，該酶切體系的建立： 在1.5mlEP管中加入如下成分：pCHOl.O質粒或puc57-VNI質粒40yl，Buffer4 10yl，AvrII和BstZ17I各5yl，滅菌水45yl，混勻后在37°C下反應5h，利用QIAGEN產 物純化試劑盒回收，分別獲得基因片段PCH01. 0和VNI。
[0025] 1. 3在T4連接酶的作用下，將已用相同酶切后回收獲得的基因片段pCHOl. 0和 VNI基因片段連接；連接反應體系如下： 在 1.5mlEP管中加入如下成分 2yl的pCH01.0,6yl的VNI，10XT4Buffer1y1，1y1的T4DNA連接酶，混勻后在室溫（20°C左右）下反應4h以上，連接產物轉化至 ToplO大腸桿菌感受態細胞中，涂布于2YT(KANA)平板培養基上37°C靜置過夜，平板編號 pCHOl. 0-VNIo
[0026] 1. 4從pCHOl.0-VNI平板中各挑取數個重組單菌落經過培養后做為PCR模板，分別 進行PCR篩選鑒定； 菌液PCR擴增反應體系（總體積20 y L) :2 X TaqHS10 y L、菌液模板2 y L、上下游引 物P1和P2各1 y L(終濃度0. 3 y mol/L)，最后用雙蒸水補至20 y L;反應條件：95°C 2min， 一個循環；94°C 60s、53°C 60s、72°C 120s，30個循環；最后72°C 5min。通過瓊脂糖凝膠電 泳分析結果，選取出具有目標產物的正確菌落。
[0027] 1. 5通過PCR篩選鑒定的菌落接種后提取再分別進行酶切鑒定；即首先進行重組 菌的質粒提取，然后進行酶切分析； 酶切體系：在1.5mlEP管中加入如下成分：質粒2yl，Bufferllyl，BSA0.lyl， AvrII和BstZ17I各1y1，補滅菌水至10y1，混勻后在37°C下反應4h。通過瓊脂糖凝膠電 泳分析結果，選取出酶切鑒定正確的菌落。
[0028] 1. 6將通過菌落PCR和酶切鑒定正確的菌落隨機接種數個菌落再進行測序鑒定， 選取出表達質粒保存備用。
[0029] 2.質粒轉染及細胞篩選 采用宿主細胞CH0-S或DG44,按照FreedomCHO-SKit試劑盒說明書分別進行質粒轉 染，轉入質粒的細胞分別置于搖瓶培養8h，搖瓶培養的條件為：37°C、8%C02、110rpm/min。通 過細胞計數儀檢測細胞活率和細胞數。
[0030] 轉染48h后進行兩步加壓篩選：10P/100M，20P/200M(P=10yg/mLPuromycin，M=nM MTX) ;30P/500M，50P/1000M，獲得初篩細胞。以有限稀釋法進行單克隆細胞篩選，通過檢測 蛋白表達量以及純度從中優選克隆逐級擴大培養。
[0031] 3?蛋白表達和純化 篩選高產克隆細胞從96孔板擴至24孔板生長，然后擴至6孔板生長，之后擴至50mL搖瓶生長。
[0032] 收集培養7天細胞培養上清液，離心除去細胞碎片，上清液以0. 45ym濾膜過 濾，調節口^1至7.4，用蛋白八瓊脂糖親和柱層析（11；[1'抑口？1'(^6；[11-六36口1^1'086 3€；1^11；^7 column)純化融合蛋白，5倍柱床體積的去離子水沖洗柱子，再用5倍柱床體積