抗cdh3抗體及其用圖
【專利說明】
[0001] 本申請是基于申請日為2009年12月28日，申請號為200980163482.X，發明名稱 為："抗CDH3抗體及其用途"的專利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及抗CDH3抗體，使用所述抗體來治療或預防或診斷CDH3相關疾病的方 法，以及包含所述抗體的藥物組合物或診斷試劑盒。
【背景技術】
[0003] 鈣粘蛋白是細胞-細胞粘附糖蛋白，它們形成鈣依賴性細胞間連接點，而且在系 統發生中及在成年組織和器官的發育和維持中發揮至關重要的作用（NPL1)。在胚胎發生 期間，特定鈣粘蛋白的細胞表達導致嗜同性相互作用，這些相互作用在細胞分選和組織分 層的過程中是至關重要的（NPL2-4)。這些細胞附著的改變在細胞失穩中發揮重要作用，而 且可改變受到細致調節的上皮結構分化過程（NPL5-6)。因為這個原因，已經有人暗示鈣粘 蛋白的功能喪失或過表達以及編碼這些蛋白的基因的背后的控制分子機制與癌發生有關 (NPL7)〇
[0004] 鈣粘蛋白家族細分成多個亞家族，包括經典的E-、P_、和N-鈣粘蛋白，每個亞家族 表現出獨特的組織分布（NPL8)。雖然E-鈣粘蛋白在所有上皮組織中表達，但是P-鈣粘蛋 白（CDH3)的表達僅僅局限于分層的上皮的基底層或下層，包括前列腺和皮膚，而且還局限 于乳腺肌上皮細胞（NPL9-10)。
[0005] 現在有大量的證據也揭示異常P-鈣粘蛋白表達與細胞增殖及與結腸、乳腺、肺、 甲狀腺、和宮頸的腫瘤有關（NPL11-12)。人P-鈣粘蛋白據報告是被針對外陰表皮樣癌生成 的NCC-CAD-299單克隆抗體識別的抗原（NPL10)。預期對P-鈣粘蛋白介導的粘附和細胞內 信號傳導的調控會導致體內腫瘤細胞增殖和存活降低。因而，鑒于P-鈣粘蛋白似乎在細胞 增殖和實體瘤進展中擁有關鍵作用，期望生成針對P-鈣粘蛋白的抗體，它能給具有多種癌 癥的患者提供治療效益。
[0006] 針對癌癥特異性分子的單克隆抗體已經證明在癌癥治療中是有用的（NPL13)。除 了用于乳腺癌、惡性淋巴瘤和結腸癌的人源化或嵌合抗體諸如曲妥單抗（NPL13)、利妥昔單 抗（NPL14)和貝伐單抗（NPL15)等臨床應用的成功例子之外，有若干針對其它分子靶標的 單克隆抗體正處于開發中，而且人們正在評估它們的抗腫瘤活性。預期這些單克隆抗體會 給具有沒有有效療法的腫瘤的患者帶來希望。關于這些單克隆抗體的其它重要問題之一， 是實現針對癌細胞的選擇性治療效果，而避免由于它們對表達靶分子的細胞的特異性反應 而造成的嚴重毒性（NPL17-19,PTL1-4)。
[0007] 引用列表
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[0013] 非專利文獻
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[0033] 發明概述
[0034] 本發明提供針對⑶H3的單克隆抗體，它們特異性識別⑶H3多肽，諸如具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽，或其片段。本發明提供了用9°Y標記的抗CDH3單克隆抗體在 攜帶癌細胞系的異種移植小鼠中具有顯著的抗腫瘤活性。
[0035] 具體而言，本發明涉及下面各項：
[0036] [1]一種抗體或其片段，其中所述抗體包含H(重）鏈V(可變）區和L(輕）鏈V 區，其中所述H鏈V區和L鏈V區選自下組：
[0037] (a)包含具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的H鏈V區中所含的互補決定區 (⑶R)或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區，以及包含具有SEQ ID N0:12的氨基酸序列的 L鏈V區中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區；
[0038] (b)包含具有SEQ ID N0:20所示的氨基酸序列的H鏈V區中所含的⑶R或與之功 能上等同的⑶R的H鏈V區，以及包含具有SEQ ID N0:28的氨基酸序列的L鏈V區中所含 的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區；
[0039] (c)包含具有SEQ ID N0:36所示的氨基酸序列的H鏈V區中所含的⑶R或與之功 能上等同的⑶R的H鏈V區，以及包含具有SEQ ID N0:44的氨基酸序列的L鏈V區中所含 的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區；和
[0040] (d)包含具有SEQ ID N0:68、72、76或80所示的氨基酸序列的H鏈V區中所含的 ⑶R或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區，以及包含具有SEQIDN0:60的氨基酸序列的L鏈V區中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區，
[0041] 且其中所述抗體能夠結合⑶H3多肽或其部分肽。
[0042] 在典型的實施方案中，所述抗體選自下組：小鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗 體、抗體片段、以及單鏈抗體。
[0043] [2]本發明的抗體或其片段能夠與細胞毒劑、治療劑、放射性同位素標記物或熒光 標記物綴合。在典型的實施方案中，抗體被放射性同位素標記物標記。在更典型的實施方 案中，放射性同位素標記物選自 9°釔（9°Y)、125碘（1251)和111銦（mIn)。
[0044] [3]在受試者中治療或預防與⑶H3有關的疾病，或抑制表達⑶H3的細胞的生長的 方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的本發明的抗體或其片段。
[0045] [4] -種用于受試者中與CDH3有關的疾病或發生該疾病的傾向的診斷或預后的 方法，其包括
[0046] (a)使來自所述受試者的樣品或標本接觸本發明的抗體或其片段；
[0047] (b)檢測所述樣品或標本中⑶H3多肽；并
[0048] (c)基于與對照相比CDH3蛋白的相對豐度來確定所述受試者是否患有或有風險 發生所述疾病。
[0049] [5]用于在受試者中治療或預防與⑶H3有關的疾病，或抑制表達⑶H3的細胞的生 長的藥物組合物，所述組合物包含有效量的本發明的抗體或其片段，以及可藥用的擔載體 或賦形劑。
[0050] [6] -種用于與CDH3有關的疾病的診斷或預后的試劑盒，該試劑盒包含本發明的 抗體或片段。
[0051] 本發明包括以下內容：
[0052] 實施方式1. 一種抗體或其片段，其中所述抗體包含H(重）鏈V(可變）區和L(輕） 鏈V區，其中所述H鏈V區和L鏈V區選自下組：
[0053] (a)包含具有SEQIDN0:4所示的氨基酸序列的H鏈V區中所含的互補決定區 (⑶Rs)或與之功能上等同的⑶Rs的H鏈V區，以及包含具有SEQIDN0:12的氨基酸序列 的L鏈V區中所含的⑶Rs或與之功能上等同的⑶Rs的L鏈V區；
[0054] (b)包含具有SEQIDN0:20所示的氨基酸序列的H鏈V區中所含的⑶Rs或與之 功能上等同的⑶Rs的H鏈V區，以及包含具有SEQIDN0:28的氨基酸序列的L鏈V區中 所含的⑶Rs或與之功能上等同的⑶Rs的L鏈V區；
[0055] (c)包含具有SEQIDN0:36所示的氨基酸序列的H鏈V區中所含的⑶Rs或與之 功能上等同的⑶Rs的H鏈V區，以及包含具有SEQIDN0:44的氨基酸序列的L鏈V區中 所含的⑶Rs或與之功能上等同的⑶Rs的L鏈V區；和
[0056] (d)包含具有SEQIDN0:68、72、76或80所示的氨基酸序列的H鏈V區中所含的 ⑶Rs或與之功能上等同的⑶Rs的H鏈V區，以及包含具有SEQIDN0:60的氨基酸序列的 L鏈V區中所含的⑶Rs或與之功能上等同的⑶Rs的L鏈V區，
[0057] 且其中所述抗體能夠結合⑶H3多肽或其部分肽。
[0058] 實施方式2.實施方式1的抗體或其片段，其中所述H鏈V區和L鏈V區選自下 組：
[0059] (&)包含具有3￡0 10勵:6所示的氨基酸序列的〇)1?1、具有3￡0 10勵:8所示的 氨基酸序列的⑶R2、和具有SEQIDNO: 10所示的氨基酸序列的⑶R3的H鏈V區，和包含具 有SEQIDN0:14所示的氨基酸序列的⑶R1、具有SEQIDN0:16所示的氨基酸序列的⑶R2、 和具有SEQIDN0:18所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區，
[0060] 〇3)包含具有3￡〇10勵:22所示的氨基酸序列的0?1、具有3￡〇10勵 :24所示 的氨基酸序列的⑶R2、和具有SEQIDN0:26所示的氨基酸序列的⑶R3的H鏈V區，和包 含具有SEQIDN0:30所示的氨基酸序列的⑶R1、具有SEQIDN0:32所示的氨基酸序列的 ⑶R2、和具有SEQIDN0:34所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區；
[0061]((：)包含具有3￡0 10勵:38所示的氨基酸序列的〇)1?1、具有3￡0 10勵:40所示 的氨基酸序列的⑶R2、和具有SEQIDN0:42所示的氨基酸序列的⑶R3的H鏈V區，和包 含具有SEQIDN0:46所示的氨基酸序列的⑶R1、具有SEQIDN0:48所示的氨基酸序列的 ⑶R2、和具有SEQIDN0:50所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區；和
[0062] (d)包含具有SEQIDN0:54所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQIDN0:70,74,78 或82所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有SEQIDNO: 58所示的氨基酸序列的⑶R3的H鏈V 區，和包含具有SEQIDN0:62所示的氨基酸序列的⑶R1、具有SEQIDN0:64所示的氨基酸 序列的⑶R2、和具有SEQIDN0:66所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區。
[0063] 實施方式3.實施方式1或2的抗體或其片段，其中所述抗體選自下組：小鼠抗體、 嵌合抗體、人源化抗體、抗體片段、和單鏈抗體。
[0064] 實施方式4.實施方式3的抗體或其片段，其中所述抗體包含具有選自SEQID NO:4, 20, 36, 68, 72, 76和80的氨基酸序列的H鏈V區，和/或具有選自SEQIDNO: 12, 28, 44 和60的氨基酸序列的L鏈V區。
[0065] 實施方式5.實施方式4的抗體或其片段，其中所述抗體包含：
[0066] (&)具有3￡〇10勵:4所示的氨基酸序列的11鏈￥區和具有3￡〇10勵：12所示的 氨基酸序列的L鏈V區；
[0067] (b)具有SEQIDN0:20所示的氨基酸序列的H鏈V區和具有SEQIDN0:28所示 的氨基酸序列的L鏈V區；
[0068] (c)具有SEQIDN0:36所示的氨基酸序列的H鏈V區和具有SEQIDN0:44所示 的氨基酸序列的L鏈V區；或
[0069] (d)具有SEQID N0:68, 72, 76或80所示的氨基酸序列的H鏈V區和具有SEQID NO: 60所示的氨基酸序列的L鏈V區。
[0070] 實施方式6.實施方式4或5的抗體或其片段，其中所述抗體是嵌合抗體。
[0071] 實施方式7.實施方式6的抗體或其片段，其中所述抗體是人源化抗體。
[0072] 實施方式8.實施方式7的抗體或其片段，其中所述人源化抗體還包含人抗體 FR(框架）區和/或人抗體C區。
[0073] 實施方式9.實施方式1-8中任一項的抗體或其片段，其中所述抗體與細胞毒劑、 治療劑、放射性同位素標記物或熒光標記物綴合。
[0074] 實施方式10.實施方式9的抗體或其片段，其中所述放射性同位素標記物選自90 釔（ 9°Y)和 111 銦（mIn)。
[0075] 實施方式11.一種用于在受試者中治療或預防與CDH3有關的疾病或抑制表達 CDH3的細胞的生長的方法，其中所述方法包括給所述受試者施用有效量的權利要求1-10 中任一項的抗體或片段。
[0076] 實施方式12.-種用于在受試者中診斷與CDH3有關的疾病或發生該疾病的傾向 的方法，其中所述方法包括
[0077] (a)使來自所述受試者的樣品或標本接觸權利要求1-10中任一項的抗體或片段；
[0078] (b)檢測所述樣品或標本中的⑶H3多肽；并
[0079] (c)基于與對照相比⑶H3多肽的相對豐度來判斷所述受試者是否患有或有風險 發生所述疾病。
[0080] 實施方式13.-種用于治療或預防與⑶H3有關的疾病或抑制表達⑶H3的細胞生 長的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含有效量的依照權利要求1-10中任一項的抗體 或片段和可藥用的擔載體或賦形劑。
[0081] 實施方式14.一種用于診斷與CDH3有關的疾病的試劑盒，其中所述試劑盒包含依 照權利要求1-10中任一項的抗體或片段。
[0082] 附圖簡述
[0083] 圖1顯示9°Y標記的抗⑶H3抗體（克隆#3、#4、#5和#6)對腫瘤生長的影響。9°Y 標記的抗⑶H3抗體，特別是克隆#3、#4、和#6,有效地抑制了裸小鼠中移植的H1373細胞的 生長，而施用無標記的抗⑶H3抗體沒有顯示腫瘤生長的抑制。
[0084] 圖2顯示抗⑶H3抗體（克隆#3、#4、#5和#6)的還原型SDS-PAGE分析。克隆#3、 #4、#5的條帶圖樣揭示了與IgG重鏈和輕鏈對應的兩條帶，而克隆#6的圖樣揭示了兩條重 鏈帶和一條輕鏈帶。
[0085] 實施方案詳述
[0086] 本發明涉及抗⑶H3抗體、包含它們的組合物、及它們在治療或預防與⑶H3有關的 疾病如癌癥中的用途。在一個典型的實施方案中，所述抗體是用放射性同位素標記物標記 的。
[0087] 已經報告了用于對自胰腺癌患者收集的胰腺癌細胞和正常細胞進行基因表達分 析的cDNA微陣列（Nakamura等，0ncogene(2004) ,23:2385-400)。隨后鑒定了在胰腺癌細 胞中表達特異性增強的多種基因。胎盤鈣粘蛋白（P-鈣粘蛋白；CDH3)，一種胞質膜蛋白，是 這些基因之一，在主要器官中呈現低表達水平。對于癌癥治療的靶基因來說這樣的特征是 合適的，因為可以避免副作用的危險。另外，在其它癌細胞系中確認了類似的CDH3過表達， 諸如肺、結腸直腸、前列腺、乳腺、胃和肝癌細胞系（W0/2007/102525)。
[0088] 定義
[0089] 如本文中使用的，術語"抗體"意圖包括與指定蛋白質或其肽特異性起反應的免疫 球蛋白及其片段。抗體可以包括人抗體、靈長類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化抗 體、融合至其它蛋白質或放射性標記物的抗體、和抗體片段。另外，本文中的抗體以最廣義 使用，而且明確覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、自至少兩種完整抗體形成的多特異性 抗體（例如雙特異性抗體）、和抗體片段，只要它們展現期望的生物學活性。"抗體"指所有 類（例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。
[0090] "抗體片段"指完整抗體的一部分，一般包含完整抗體的抗原結合區或可變區。因 而，在本發明中，抗體片段可以包含完整抗體的一個或多個抗原結合部分。如本文中使用 的，術語抗體的"抗原結合部分"指抗體保留特異性結合抗原（例如CDH3)的能力的一種或 多種免疫學活性片段。已經顯示抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段來實施。抗體 片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab'）2、和Fv片段；線性抗體；和單鏈抗體分子。不管結構如 何，抗體片段結合被完整抗體識別的同一抗原。術語"抗體片段"還包括結合特定抗原的合 成的或遺傳工程改造的多肽，諸如由輕鏈可變區組成的多肽、由重鏈和輕鏈可變區組成的 "Fv"片段、其中輕鏈和重鏈可變區通過肽接頭相連接的重組單鏈多肽分子（"scFv蛋白")、 和由模擬高變區的氨基酸殘基組成的最小識別單位。
[0091] 如本文中使用的，與⑶R"功能上等同"是指⑶R賦予具備它們的抗體以與具有原 CDR的抗體基本上相等的抗原結合活性和抗原特異性。與CDR功能上等同的例子包括原始 CDR替換、缺失、插入和/或添加一個或多個氨基酸殘基者。只要保持抗原結合活性和抗原 特異性，氨基酸突變的數目和百分比沒有特別限制。不過，一般優選改變可變區中所含的原 始⑶R的氨基酸序列的20 %以下。更優選地，突變的百分比為15%以下，10%以下，5%以 下。在優選的實施方案，氨基酸突變的數目是10個以下，5個以下，4個以下，3個以下，2個 以下，1個以下。本領域技術人員會理解可以接受的保留原始CDR的性質的突變。
[0092] 抗體的牛成
[0093] 本發明使用針對⑶H3的抗體。這些抗體將通過已知方法來提供。
[0094] 描述了用于生成依照本發明使用的抗體的例示技術。
[0095] (i)單克降抗體
[0096] 單克隆抗體是從一群基本上同質的抗體獲得的，基本上同質即構成群體的各個抗 體是相同的，除了可能以極小量存在的天然突變外。因此，修飾語"單克隆"表示抗體的這 樣的特征，即其不是分立（discrete)抗體的混合物。
[0097] 例如，單克隆抗體可通過最初由Kohler等，Nature 256:495 (1975)描述的雜交瘤 方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備（美國專利4, 816, 567)。
[0098] 在雜交瘤方法中，用CDH3多肽免疫小鼠或其它合適的宿主動物，諸如倉鼠，以引 發出生成或能夠生成會特異性結合CDH3多肽的抗體的淋巴細胞。或者，可以在體外用CDH3 多肽免疫淋巴細胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融 合，以形成雜交瘤細胞（Goding，《MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice》， 59-103,AcademicPress,1986)〇
[0099] 將制備的雜交瘤細胞在合適的培養基中接種和培養，所述培養基優選含有抑制未 融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏酶 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養基通常可含有次黃 嘌呤、氨基喋呤和胸苷（HAT培養基），這些物質阻止HGPRT缺陷細胞生長。
[0100] 優選的骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細胞穩定的高水平生成抗 體、并對諸如HAT培養基等培養基敏感的骨髓瘤細胞。優選的骨髓瘤細胞系包括鼠源骨 髓瘤系，諸如可從SalkInstituteCellDistributionCenter(SanDiege，California， USA)獲得的M0PC-21和MPC-11小鼠腫瘤的衍生鼠源骨髓瘤系，及可從AmericanType Cultu