鮑曼不動桿菌亞單位疫苗抗原蛋白與應用
【技術領域】
[0001]
本發明涉及分子生物學及免疫學領域，具體的說是一種免疫保護性亞單位疫苗及其應用。
【背景技術】
[0002]
隨著醫藥技術的飛速發展，特別是抗生素的廣泛使用，使感染性疾病的救治水平得到不斷的提高，但隨之而來的是抗生素濫用現象的增多，在抗生素的強大壓力下，產生了大量的耐藥菌株，這些耐藥菌多次與藥物接觸后，對藥物的敏感性減小甚至消失，致使藥物對耐藥菌的療效降低甚至無效。不動桿菌是近年來醫院院內感染中分離率增長較快的菌種，其中鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii, Ab)已成為臨床最為常見的院內感染病原菌。
[0003]鮑曼感染可引發敗血癥、軟組織或傷口感染、插管相關感染、尿路感染、菌血癥、繼發性腦膜炎等。鮑曼對危重患者威脅尤其嚴重，特別容易在重癥監護病房(ICU)引起爆發流行，具有高的致死率。
[0004]鮑曼不動桿菌可引起嚴重臨床危害的主要原因是:(I)鮑曼在醫院環境中分布很廣且可長期存活，主要存在人的皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，對濕熱、紫外線、化學消毒劑有較強抵抗力，常規消毒劑只能抑制其生長而不能將其殺滅。(2)尤為重要的是，鮑曼耐藥機制復雜，耐藥性嚴重。近年來，許多省份均已出現鮑曼播散和流行。有研究表明:鮑曼主要是通過多種抗生素水解酶的表達、外膜通透屏障、藥物主動外排栗等機制的協同作用而呈現多重耐藥性。
[0005]鮑曼耐藥性逐年增強，近年來甚至出現“全耐藥”菌株，許多現有抗生素的治療作用已不明顯，給臨床治療帶來了很大的難題。新的抗生素發展緩慢，且鮑曼耐藥性適應迅速，因此，尋求新的解決方案顯得極為重要。國內目前對鮑曼不動桿菌研究很大部分都集中于院內鮑曼耐藥性的動態變化監測，或是耐藥機制的研究。國外的研究主要從耐藥機制，致病機理和耐藥性的變化等方面入手，關于疫苗方面的研究主要集中在不動桿菌滅活的全菌，全外膜蛋白(OMPs)和外膜蛋白囊泡(OMVs)的免疫原性和保護性的研究上。Michael J.McConnell等人的研究結果表明，OMPs和OMVs免疫的小鼠能抵抗鮑曼的感染和侵襲，同時還證明小鼠接受抗血清被動免疫同樣能抵抗鮑曼的感染和侵襲。
[0006]值得注意的是，鮑曼不動桿菌OMPs或OMVs由許多蛋白組成，而這些蛋白的分離和純化是一個繁雜的過程，且產量很難得到提高，有效成分與大量無關蛋白及雜質混雜。雖然用OMPs或OMVs免疫相對于全菌免疫安全性上有所提高，但其中包含了菌體的很多外膜和細胞壁成分，包括LPS在內，仍會產生顯著的毒副作用。
[0007]利用免疫信息學和反向遺傳學，分析多重耐藥不動桿菌外膜蛋白成分的抗原性及免疫原性，并進行基因克隆，蛋白表達、純化，以及免疫學研究，篩選出有效的外膜蛋白成分，探討鮑曼不動桿菌免疫控制策略的潛能，將提升疫苗的有效性和安全性，因而較之OMPs, OMVs或者全菌疫苗具有更加現實和誘人的應用前景。
【發明內容】
[0008]
將鮑曼不動桿菌菌株ATCC 17978在LB培養基中培養，培養至對數期時收集菌體，以菌體為模板進行PCR擴增，獲得鮑曼不動桿菌ATCC 17978 OmpW的核酸序列(SEQ ID NO:1所示)，雙酶切后以基因工程手段連入原核表達載體，將重組質粒轉化進入大腸桿菌DH5 α后挑取陽性重組子，提取質粒進行測序鑒定。
[0009]將OmpW重組質粒轉化進BL21 (DE3)感受態細胞，以IPTG誘導表達重組OmpW蛋白(SEQ ID NO:2所示)，表達產物經超聲波破碎后收集包涵體并將其溶解、重折疊。
[0010]將重折疊后的蛋白以陽離子柱及親和柱進行純化后獲得重組OmpW蛋白。
[0011]將該重組蛋白與氫氧化鈉鋁佐劑1:1混合后免疫小鼠，收集免疫后小鼠血清，進行ELISA檢測抗鮑曼不動桿菌OMVs的特異性抗體滴度，發現經OmpW免疫后小鼠體內產生了較高的特異性抗體水平；并以該抗OmpW血清進行Western blot檢測多株臨床分離的鮑曼不動桿菌菌體蛋白，發現該抗體能特異性識別多株臨床鮑曼不動桿菌菌體中的OmpW蛋白。
[0012]向小鼠腹腔注射臨床分離的耐藥鮑曼不動桿菌，連續觀察一周，發現經OmpW免疫后的小鼠存活率為100%，對照組存活率僅為16.7%，同時在小鼠外周血、肝臟、肺、腎臟、脾臟中的細菌載量在疫苗組中較對照組降低了 14-1O6倍，且在血清中的炎癥細胞因子水平顯著降低，顯示了該亞單位疫苗抗原具有較高的免疫保護性。
[0013]將OmpW免疫后小鼠的抗血清通過尾靜脈注射進小鼠體內，再以臨床分離的耐藥鮑曼不動桿菌感染，發現被動免疫后的小鼠保持了 83.3%的存活率，而對照組僅為16.7%，在小鼠外周血、肝臟、肺、腎臟、脾臟中的細菌載量在疫苗組中較對照組降低了 12-1O3倍，且在血清中炎癥細胞因子水平顯著降低，顯示了針對OmpW的抗血清具有被動免疫保護效果，在體內具有有效的殺菌活性。
[0014]經體外調理實驗證明OmpW抗體具有體外調理殺傷活性，能起到調理素作用特異性殺傷多株臨床分離的鮑曼不動桿菌，體現了 OmpW作為鮑曼不動桿菌亞單位疫苗的廣泛交叉保護性。
【附圖說明】
[0015]
圖1顯示了鮑曼不動桿菌亞單位疫苗抗原OmpW的主動免疫及被動免疫程序，以及臨床分離的鮑曼不動桿菌菌株的感染程序。
[0016]圖2顯示了融合表達的OmpW在BL21 (DE3)菌株中誘導表達前后的情況，及純化后的蛋白情況，圖片為考馬斯亮藍染色后全菌及純化蛋白的SDS-PAGE分析。
[0017]圖3顯示了經亞單位疫苗抗原OmpW最后一次免疫后I周及3周后小鼠血清中特異性抗體的滴度水平(n=6)。
[0018]圖4顯示了以Western blot檢測OmpW抗血清特異性識別臨床分離的鮑曼不動桿菌菌株的情況，以抗鮑曼不動桿菌OMV (AbOMVs)抗體為陽性對照，對照血清為陰性對照。
[0019]圖5顯示了經OmpW主動免疫后，感染鮑曼不動桿菌的小鼠存活率情況(n=6)。
[0020]圖6顯示了經OmpW被動免疫后，感染鮑曼不動桿菌的小鼠存活率情況(n=6)。
[0021]圖7顯示了經OmpW主動免疫后，感染鮑曼不動桿菌的小鼠各器官載量情況(n=6)。
[0022]圖8顯示了經OmpW被動免疫后，感染鮑曼不動桿菌的小鼠各器官載量情況(n=6)。
[0023]圖9顯示了經OmpW主動免疫后，感染鮑曼不動桿菌的小鼠血清中炎癥細胞因子分泌情況(n=6)。
[0024]圖10顯示了經OmpW被動免疫后，感染鮑曼不動桿菌的小鼠血清中炎癥細胞因子分泌情況(n=6)。
[0025]圖11顯示了梯度稀釋及熱滅活補體后的抗OmpW血清的體外細菌殺傷活性，顯示了該抗血清能有效殺傷鮑曼不動桿菌并依賴于巨噬細胞。
[0026]圖12顯示了抗OmpW血清對不同來源的臨床分離菌株的體外調理殺傷情況。
[0027]SEQ ID NO:1為本發明中鮑曼不動桿菌外膜蛋白W (Ompff)的基因序列。
[0028]SEQ ID NO:2為本發明中鮑曼不動桿菌外膜蛋白W (Ompff)的氨基酸序列。
【具體實施方式】
[0029]
通過以下實施例詳細描述本發明，以便本領域普通技術人員能夠更好地理解本發明。下述實施例僅僅出于示范性目的，并非意在限制本發明的范圍。已經努力確保有關數字的準確性，但應該考慮到會存在一些誤差和偏差。
[0030]實施例
實施例1:鮑曼不動桿菌外膜蛋白OmpW原核表達質粒的構建
將鮑曼不動桿菌菌株ATCC 17978在LB培養基中過夜培養，待菌體生長至對數期(OD6qq=0.4-0.6)，取菌液進行 PCR 擴增，PCR 擴增引物為 OmpW-F (5’ GGATCC ATG GGG GTGTCT TCA TTT ACT T 3，)和 OmpW-R (5，GAATTC TTA GAA TTT ATA GCT ATA GCC T 3，)；PCR 體系具體為:菌液:2 μ L