用于治療糖尿病相關并發癥的組合物和方法
【專利說明】
[0001] 本申請遵照美國專利法第35條第119款（e)項的規定要求于2013年1月30日 提交的美國臨時申請No. 61/758, 511的權益。通過引用將上述申請并入本文。
[0002] 本發明是遵照美國國立衛生研究院授予的批準號為R01HL085061的文件而在政 府支持下進行的。政府在本發明中擁有某些權益。
技術領域
[0003] 本發明涉及糖尿病領域，具體地，公開了用于抑制、治療和/或預防糖尿病相關病 癥/并發癥的組合物和方法。
【背景技術】
[0004] 整個說明書引用一些出版物和專利文獻，來描述本發明所屬領域的技術現狀。通 過引用猶如全文闡述般將這些引文中的每一個并入本文。
[0005] 對于美國超過130萬患有I型糖尿病（TlD)的個體，可以采用不同持續時間胰島 素、胰島素遞送栗、葡萄糖監測設備、食物管理以及運動策略將血糖維持在接近生理水平。 這種多管齊下的方法在最近30年內在以下幾方面已經取得了一些成績：減少了包括失明、 腎衰竭、糖尿病性心肌病/心力衰竭、勃起功能障礙以及中風在內的已知心血管并發癥的 發生率，并且使患有TlD個體的預期壽命增加超過15歲至±69歲。遺憾的是，壽命的增加 也暴露了與TlD相關的更新的伴隨疾病，包括認知障礙。后者早在TlD發病后的±10-15 年就已出現，表現為信息處理速度、精神運動功能、認知靈活性、視覺感知和注意力等方面 的減退。有趣的是，學習和記憶能力不受影響。來自糖尿病控制和并發癥臨床試驗（DCCT) 和糖尿病干預和并發癥流行病學（EDIC)研究組以及其他研究組的最新數據表明，整體認 知功能的降低與低血糖事件無關，但與微血管并發癥的程度關系密切。引發腦微血管病的 內在分子以及預防或減緩其發展的治療策略仍不明確。目前，有9類FDA批準的藥物可用 于整體降糖。然而，沒有特異靶向于糖尿病心血管并發癥的FDA批準藥物。因此，很明顯， 仍然需要用于治療糖尿病并發癥的新的有效治療方法。
【發明內容】
[0006] 根據本發明，提供了用于治療、抑制和/或預防受試者中以丙酮醛的過表達為特 征的疾病或病癥的方法。在一個特定的實施方案中，本發明的方法包括對需要其的受試者 施用編碼丙酮醛降解酶（例如乙二醛酶-1)的核酸分子。在一個特定的實施方案中，由丙酮 醛的過表達表征的疾病或病癥為糖尿病、糖尿病相關并發癥或血管疾病。可將在載體尤其 是病毒載體中的編碼丙酮醛降解酶的核酸分子施用于受試者。編碼丙酮醛降解酶的核酸分 子可以可操作地連接至內皮細胞啟動子或平滑肌細胞啟動子。在一個特定的實施方案中， 編碼丙酮醛降解酶的核酸分子可操作地連接至內皮素-1啟動子。在一個特定的實施方案 中，所述病毒載體為腺相關病毒載體。
【附圖說明】
[0007] 圖IA提供了在指明的治療后對照組大鼠或鏈脲霉素誘導的1型糖尿病大鼠（起 始體重為約220g)的體重（上）和血糖水平（下）隨時間的變化曲線圖。圖IB提供了在 指明的治療后對照組大鼠或鏈脲霉素誘導的1型糖尿病大鼠（起始體重約為275g)的體重 (上）和血糖水平（下）隨時間的變化曲線圖。
[0008] 圖2A提供了對照組雄性和雌性2型糖尿病小鼠（瘦素受體缺陷）或注射 AAV2/9-End 〇Gl〇-l的小鼠的體重隨時間的變化曲線圖。圖2B提供了對照組雄性和雌性2 型糖尿病小鼠（瘦素受體缺陷）或注射AAV2/9-End 〇Gl〇-l的小鼠的血糖水平隨時間的變 化曲線圖。
[0009] 圖3提供了在指明的治療后對照組大鼠或鏈脲霉素誘導的1型糖尿病大鼠的嵌套 評分（nesting score)圖。
[0010] 圖4A和圖4B示出了在指明的治療后鏈脲霉素誘導的1型糖尿病大鼠的微血管舒 張百分比。圖4A示出了內皮依賴性舒張，圖4B示出了平滑肌依賴性舒張。
[0011] 圖5A提供了對照組大鼠、鏈脲霉素誘導的1型糖尿病大鼠或用AAV2/9End〇-Gl〇-l 治療的鏈脲霉素誘導的1型糖尿病大鼠的大腦皮層血管滲漏、大腦海馬和丘腦圖像。圖5B 提供了在指明的治療后對照組大鼠或1型糖尿病大鼠的大腦毛細血管灌注圖。
[0012] 圖6A提供了對照組大鼠的微血管內皮免疫組織化學圖像。圖6B提供了 I型糖尿 病大鼠的微血管內皮免疫組織化學圖像。圖6C提供了用AAV2/9-End〇-Gl〇l治療的I型糖 尿病大鼠的微血管內皮免疫組織化學圖像。
[0013] 圖7提供了隨著丙酮醛濃度的增加，人腦微血管內皮細胞（上）、人腦微血管平滑 肌細胞（中）和人星形膠質細胞（下）的細胞活力百分比圖。
[0014] 圖8A提供了輸入-輸出響應的初始斜率，圖8B提供了來自對照組大鼠、I型糖尿 病大鼠和用AAV 2/9-Endo-Glol治療的I型糖尿病大鼠的海馬體切片中突觸傳遞的雙脈沖 比值。
[0015] 圖9提供了急性缺血再灌注損傷后大鼠的腦圖像（上）和梗死面積圖（下）。在 本研究中使用了對照組大鼠、I型糖尿病大鼠、用AAV 2/9-Endo-Glol治療的I型糖尿病大 鼠和用AAV 2/9-Glol (缺乏內皮細胞啟動子）治療的I型糖尿病大鼠。
[0016] 圖10提供了相位影像（左列）和檢測來自對照組大鼠（上）、1型糖尿病大鼠（中 間）、用AAV 2/9-Endo-Glol治療的I型糖尿病大鼠（下）的腎臟切片的異硫氰酸熒光素標 記牛血清白蛋白（BAS-FITC)(右列）的圖像。
【具體實施方式】
[0017] 目前，對于與糖尿病相關的心血管并發癥如心力衰竭（心肌病）、腎衰竭、視網膜 病變和神經病變的管理是一項重大醫療保健挑戰。當前策略采用改變生活方式（例如，多 運動和食物管理）、胰島素和其他降糖藥物相結合。還使用降血脂和抗高血壓藥物來控制 混雜因素。遺憾的是，目前的策略往往是：利用最近診斷的患有1型和2型糖尿病的年輕個 體比用患有慢性和/或長期糖尿病的個體得出更有利的結果。此外，由于擔心出現低血糖 (癥狀嚴重時，低血糖的處理更具挑戰性），所以不可能在所有患者中實現降低并發癥所需 的血糖控制水平。隨著患有糖尿病的個體的預期壽命繼續增加，顯露出額外的并發癥，包括 最近發現的認知功能下降。
[0018] 內皮是腦血管內腔中的高度特化的單層細胞，通過合成和釋放血管舒張物質（例 如，一氧化氮）和血管收縮物質（例如，血栓素A)調節血管張力和血流。內皮細胞（EC)也 是血腦屏障不可或缺的組分。EC的損傷/紊亂是包括阿爾茨海默氏病和中風在內的許多腦 血管疾病的確定原因。內皮功能紊亂也可能是患有TlD的個體認知能力減退的潛在原因。 雖然高血糖作為催化劑，但是葡萄糖本身不是導致內皮功能紊亂的原因。由高血糖導致的 新陳代謝和細胞生物化學的變化產生的活性氧類物質和炎癥介質被認為是主要的候選因 素。
[0019] 微血管是運輸營養物質和消除廢物的器官內的小血管系統。這些血管中最小的叫 做毛細血管。小動脈和小動脈分支將營養物質運輸至毛細血管，并且小靜脈將廢物從毛細 血管運輸出去。微血管腔內為單層特化細胞，統稱為內皮。這些細胞合成調節血管張力、凝 血和炎癥的化學物質并將其釋放至這些細胞的微環境中。終末器官內用于局部控制血流、 血壓和營養物質遞送/廢物排出所需的微血管的動態血管張力由響應由EC分泌的物質的 3-5層平滑肌細胞（SMC)的行為決定。在TlD中，EC合成和/或分泌這些血管調節因子的 能力減弱，并且這種缺陷可能是引發終末器官功能障礙的原因。體內合成的最強有力的"內 皮損傷"物質之一是丙酮醛，并且其產生在TlD中上調。
[0020] 高血糖增加了兩組細胞氧化劑（活性氧類物質（ROS)和活性羰基類物質（RCS)) 的產生。通過激活NAD(P)H氧化酶、黃嘌呤氧化酶以及線粒體電子傳遞鏈的復合物I和III 產生前體R0S、超氧陰離子02 ? _。這些物種通過與主要的血管舒張因子一氧化氮（NO)反 應和減少主要的血管舒張因子一氧化氮（NO)來損害內皮功能。然而，使用抗氧化劑（包括 維生素C、維生素E和(6-胡蘿卜素）進行治療的臨床研究表明，對患有糖尿病個體的心血 管功能僅有最低限度的改善。對這些臨床數據的一種解釋是02 或其代謝物（0H、H0C1、 H202)不是心血管功能障礙的引發因素，而是由上游過程產生的次要結果。
[0021] 活性羰基類物質（RCS)為小的、親電子、單羰基或二羰基物種，包括但不限于丙烯 醛、N-羧基（甲基）賴氨酸、N-羧基（乙基）賴氨酸3-脫氧葡萄糖酮醛、乙二醛（GO)、咪 唑啉酮、4-羥基壬烯醛、精氨嘧啶、丙二醛和丙酮醛（MG)。這些物種由多種來源產生，包括 葡萄糖的自氧化和葡萄糖、脂質和蛋白質的酶促降解。RCS不是功能上良性的代謝副產品， 然而，它們調節重要的細胞和生理過程，包括細胞生長、分化、增殖、凋亡和睡眠。RCS不帶 電，與ROS (毫秒）相比具有更長的半衰期（數分鐘至數小時），這允許它們迀移并在遠離 其產生地的位置發揮它們的作用。RCS最著名的效應是它們與蛋白質上的堿性氨基酸殘基 反應形成羰基加合物的能力，所述羰基加合物包括晚期糖基化終末產物（AGEs)和晚期脂 質過氧化終產物（ALEs)。RCS還可以激活晚期糖基化終產物（RAGEs)的膜結合受體，引發 促炎細胞因子、趨化因子和粘附分子的產生以及增加氧化應激和細胞凋亡。RCS的細胞水 平受到幾種RCS降解酶的嚴格調控，所述RCS降解酶包括谷胱甘肽硫轉移酶（hGSTA4-4和 hGST5. 8)、醛糖還原酶、乙醛脫氫酶和乙二醛酶。在TlD中，RCS和RCS降解酶的產生上調。 然而，產生的RCS的量超過RCS降解酶的能力，產生可以與蛋白質上的易感堿性氨基酸殘基 發生不可逆反應的"游離的RCS"，從而改變它們的功能。并不是所有糖尿病中上調的RCS 均與所有細胞蛋白質發生反應并破壞所有細胞蛋白質的功能。例如，發現雖然在心肌細胞 中丙酮醛、乙二醛、丙二醛和4-羥基壬烯醛上調，但是僅丙酮醛和乙二醛在體內與2型利阿 諾定受體和肌（內）質網Ca2+ATP酶形成加合物。丙酮醛也是在糖尿病患者中觀察到的痛 覺過敏的原因。
[0022] 丙酮醛是到目前為止鑒定的最有效的RCS。丙酮醛擾亂細胞內Ca2+穩態，并損害 線粒體功能，觸發細胞功能失調和/或死亡。丙酮醛是由磷酸丙糖中間體的氧化而合成、經 由丙酮單氧酶/丙酮醇單氧酶（AMO)由丙酮/丙酮醇來合成、以及經由膜結合酶血管粘連 蛋白-I