具有選擇性自噬途徑的滅活組分的絲狀真菌細胞及其使用方法
【專利說明】具有選擇性自噬途徑的滅活組分的絲狀真菌細胞及其使用 方法
[0001 ] 對序列表的引用
[0002] 本申請包含計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式通過引用結合在此。 發明領域
[0003] 本發明涉及經修飾的絲狀真菌細胞以及使用此類經修飾的絲狀真菌細胞用于生 產生物化合物如多肽（例如，酶）的方法。
[0004] 發明背景
[0005] 自噬是真核細胞中的一種系統，其中使用液泡/溶酶體消化細胞質組分和細胞 器。自噬與饑餓期間連同生長和發育中的營養再循環連同其他細胞事件相關聯。自噬機 制是復雜的，并且可涉及被指定為以下各項的超過30個自基因的相互作用：atgl、atg2、 atg3、atg4、atg5、atg6、atg7、atg8、atg9、atgl0、atgll、atgl2、atgl3、atgl4、atgl5、atgl6、 atgl7、atgl8、atgl9、atg20、atg21、atg22、atg23、atg24、atg25、atg26、atg27、atg28、 atg29、atg30、和atg31 基因D
[0006] 自噬和這些自噬基因中的許多的作用已經在大量的真核細胞中（包括在酵母 和絲狀真菌中）進行了研究。馬滕（Marten)等人，"在絲狀真菌中的自(Autophagy infilamentousfungi)"，真菌遺傳學和生物學（FungalGeneticsandBiology)， 46(2009)，1-8 ;艾斯丘（Askew)等人，"在煙曲霉中金屬離子缺乏型與自噬之間的不 期望的耳關系(UnexpectedlinkbetweenMetalIonDeficiencyandAutophagyin Aspergillusfumigatus)"，真核細胞（EukaryoticCell)，2007 年 12 月，2437-2447 ;北元 (Kitamoto)等人，"ATG8同源物Aoatg8的功能分析以及自在米曲霉的分化和發生中的 作用（FunctionalanaylysisoftheATG8HomologoueAoatg8andRoleofAutophagy inDifferentiationandGerminationofAspergillusoryzae)''，真核細胞（Eukaryotic Cell)，2006 年 8 月，1328-1336;北元（KitamotoK.)和菊間T(KikumaT)，"通過破壞 Aoatgl3、Aoatg4、和Aoatgl5 基因分析在米曲霉中的自卩麓（Analysisofautophagyin AspergillusoryzaebydisruptionofAoatgl3,Aoatg4,andAoatgl5genes)"，FEMS微 生物學通訊（FEMSMicrobiolLett)316(2011)61_69;歌林斯凱（Klionsky)等人，"Atgl 激酶復合體參與蛋白招募的調控以起始對釀酒酵母中的非特異性自噬的囊泡形成的隔絕 (TheAtglKinaseComplexIsInvolvedintheRegulationofProteinRecruitment toInitiateSequesteringVesicleFormationforNonspecificAutophagyin Saccharomycescerevisiaes)"，細胞分子生物學細胞（MolecularBiologyofthe Cell)，第19卷，2008年2月19日，668-681;范德爾（vanderKlei)，"自噬缺陷促進 旦_ 乳胺在產黃青霉中的產生（AutophagyDeficiencyPromotes0-LactamProduction inPeniciliumchrysogenum) "，應用與環境微生物學（AppliedandEnvironmental Microbiology)，第 77 卷，2011 年 2月 4 日，1413-1422;歌林斯凱（Klionsky)等人，"在 酵母釀酒酵母中肌動蛋白細胞骨架是選擇性自噬類型所需要的，但非特異性自噬并不需 要（TheActinCytoskeletonIsRequiredForSelectiveTypesofAutophagy,but NotNonspecificAutophagy,intheYeastSaccharomycescerevisiae) "，細胞分子 生物學（MolecularBiologyoftheCell)，第 16 卷，2005 年 12 月，5843-5865;歌林斯 凱D.J.(KlionskyD.J.)和張H.(CheongH.)，"Atgl在釀酒酵母中調節自-特異性 PAS組裝的雙重作用（DualroleofAtglinregulationofautophagy-specificPAS assemblyinSaccharomycescerevisiae)"，自IM(Autophagy)J=S, 2008 年 7月，724-726; 鐘（Chung)等人，"ATG1和自噬調節劑通過負向調節S6激酶抑制細胞生長（ATG1，and autophagyregulator,inhibitcellgrowthbynegativelyregulatingS6kinase) '，， ￡]\^0報告出]\^0 1印〇竹8)，第8卷，第4期，（2007)，360-365;水島（]\^21181111^)，"3七81/ ULKl復合物在自卩策調節中的作用（Theroleoftheatgl/ULKlcomplexinautophagy regulation)"，細胞生物學當前觀點（CurrentOpinionCellBiology)，22:132-139 (2010); 北元（Kitamoto)等人，"Aoatgl的功能分析以及在米曲霉中Cvt途徑的檢測（Functional analysisofAoatglanddetectionoftheCvtpathwayinAspergillusoryzae) '，， (2012);歌林斯凱D.(KlionskyD.)&尾上松T(YorimitsuT)，"Atgll將貨物與細胞質至 液泡革向途徑中的囊泡形成機制相聯系（AtgllLinksCargototheVesicle-forming MachineryintheCytoplasmtoVaculoeTargetingPathway) "，細胞分子生物學 (MolecularBiologyoftheCell)，第 16 卷，2005 年 4月 16 日，159301605;以及K?鈴木 (K.Suzuki)，"在芽殖酵母中的選擇性自卩策（Selectiveautophagyinbuddingyeast)"， 細胞死亡和分化（CellDeathandDifferentiation) (2013)20,43-48。
[0007] 然而，自噬系統和自噬基因的全部作用尚未完全闡明。
[0008] 發明概述
[0009] 本發明涉及經遺傳修飾的絲狀真菌宿主細胞，其中一種絲狀真菌細胞的該選擇性 自噬系統已經部分或完全失活，并且涉及在此類經修飾的宿主細胞中多肽的產生。絲狀真 菌細胞的選擇性自噬系統的失活導致感興趣的生物產品（如一種感興趣的多肽）的表達產 量增加。在一個具體實施例中，本發明提供了一種經修飾的絲狀真菌宿主細胞，包括一種部 分或完全失活的選擇性自噬系統，其中該經修飾的絲狀真菌宿主細胞已經用編碼感興趣的 生物產品的基因（如編碼一種感興趣的多肽（例如酶）的基因）進行轉化。在一種絲狀真 菌細胞中該選擇性自噬系統的活化可以通過缺失或破壞參與絲狀真菌細胞的選擇性自噬 途徑的一種或多種基因/蛋白（atg基因/蛋白質）來完成，包括通過缺失、破壞、或沉默存 在于該絲狀真菌細胞中的內源atgll活性和/或通過缺失或破壞直接或間接地參與該絲狀 真菌細胞的選擇性自噬途徑中的atgll活性的一種或多種基因/蛋白。
[0010] 本發明涉及經遺傳修飾的絲狀真菌宿主細胞，其中絲狀真菌細胞的atgll活性已 經例如通過缺失或破壞存在于該絲狀真菌細胞中的內源atgll基因的表達而被缺失、破壞 或沉默。絲狀真菌宿主細胞中的atgll活性的缺失、破壞或沉默導致感興趣的生物產品（如 感興趣的多肽）的表達產量增加。在一個具體實施例中，本發明提供了一種經修飾的絲狀 真菌宿主細胞，該細胞包括一種缺失或破壞或沉默的atgll基因，該絲狀真菌宿主細胞已 經用編碼感興趣的生物產品的基因（如編碼一種感興趣的多肽（例如酶）的基因）進行轉 化。
[0011] 本發明還提供了用于生產經修飾的絲狀真菌宿主細胞的方法，其中該真菌細胞的 atgll活性已經被缺失或破壞或沉默。在一個具體實施例中，本發明提供了一種用于生產絲 狀真菌宿主細胞的方法，該方法包括缺失或破壞絲狀真菌細胞中的atgll基因。在另一個 實施例中，本發明提供了一種用于生產絲狀真菌宿主細胞的方法，該方法包用編碼感興趣 的生物產品（如感興趣的多肽）的表達載體來轉化絲狀真菌細胞，并且其中該絲狀真菌細 胞已經被修飾或被進一步修飾以包括該atgll基因的缺失或破壞或沉默。
[0012] 本發明進一步提供了用于生產感興趣的生物化合物的方法，這些方法包括使用經 修飾的絲狀真菌宿主細胞重組生產感興趣的多肽，其中該真菌細胞的atgll活性已經缺失 或破壞。在一個具體實施例中，本發明包括培養一種包括編碼感興趣的多肽的基因的絲狀 真菌細胞，其中該真菌細胞的atgll基因已經缺失或破壞。該培養發生在有益于誘導感興 趣的異源多肽的條件下，可以從培養基中回收該異源多肽以用在一個或多個應用中，或可 替代地，可以將包含感興趣的多肽的培養基或發酵液用于一個或多個應用中。
[0013] 可以應用本發明的這些宿主細胞和方法以產生任何感興趣的生物產品。在具體 的實施例中，這些經修飾的絲狀宿主細胞和方法被應用以產生一種感興趣的多肽，如激素、 酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報告基因。本發明的具體實施例針對將本發明的經修 飾的絲狀真菌宿主細胞和方法用在重組生產感興趣的酶中。
[0014] 發明的詳細說明
[0015] 定義
[0016] Atgll:術語"atgll"是指自噬相關蛋白，其被認為是一種參與選擇性自噬的適配 器蛋白。Atgll蛋白和編碼核酸序列的實例在本領域中是已知的，并且包括例如，具有SEQ IDN0:2的氨基酸的黑曲霉atgll蛋白，如由SEQIDNO: 1中所示的核酸序列所編碼。其 他atgll蛋白和基因已經如例如在米曲霉和構巢曲霉中進行了表征。因為在真菌細胞中 atgll基因以及蛋白是結構上和功能上相似的，在其他真菌宿主中其他atgll基因和蛋白 (atgll基因和蛋白質同源物）可以使用常規分子生物學方法來鑒定。本領域中普通技術 人員還應當認識到atgll序列的變化可以發生在不同的細胞系中，這不會改變該蛋白質功 能。
[0017] 生物產品：術語"生物產品"是指在一種絲狀真菌宿主細胞中產生的任何感興趣的 產物。該生物產品可以是如下表達產物，其產量通過選擇性的自噬途徑的部分或完全失活 (例如，通過atgll的缺失或破壞）來直接增加；或一種產品，它產生自通過選擇性的自噬 途徑的失活（例如，通過該atgll活性破壞或缺失）直接增加的一種表達產物的作用。
[0018] cDNA:術語"cDNA"是指可以通過從得自真核或原核細胞的成熟的、剪接的mRNA分 子進行反轉錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對應基因組DNA中的內含子序列。 早先的初始RNA轉錄本是mRNA的前體，其在呈現為成熟的剪接的mRNA之前要經一系列的 步驟進行加工，包括剪接。
[0019] 編碼序列：術語"編碼序列"意指直接指定一個多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編 碼序列的邊界一般由一個開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從一個起始密碼子（如ATG、 GTG或TTG)開始并且以一個終止密碼子（如TAA、TAG或TGA)結束。編碼序列可以是一種 基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0020] 控制序列：術語"控制序列"意指對于編碼成熟多肽的多核苷酸的表達為必要的核 酸序列。每個控制序列對于編碼該多肽的多核苷酸來說可以是天然的（即，來自相同基因） 或外源的（即，來自不同基因），或相對于彼此是天然的或外源的。此類控制序列包括但不 限于前導子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、以及轉錄終止子。至少，控制 序列包括啟動子，以及轉錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼一種 多肽的多核苷酸的編碼區連接的特異性限制酶切位點的目的，這些控制序列可以提供有多 個接頭。術語"控制序列"在此被定義為包括對于一種多肽的表達而言必要或有利的所有 組分。
[0021 ] 該控制序列可以是適當的啟動子序列，即由宿主細胞識別以表達核酸序列的一種 核酸序列。該啟動子序列包括介導多肽表達的轉錄控制序列。該啟動子可以是在所選擇的 宿主細胞中顯示出轉錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的及雜合的啟動子，并且可 以是從編碼與該宿主細胞同源抑或異源的細胞外或細胞內多肽的基因獲得。
[0022] 用于指導該核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的適合啟動子的實例是從 米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶