出血熱相關病原體鑒別基因芯片的制備和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及十六種出血熱相關病原體核酸檢測基因芯片的制備和用途，屬基因芯 片檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 病毒性出血熱（ViralHemorrhagicFever，VHF)是一組由不同類型病毒引起， 以發熱、出血為主要臨床癥狀的一組自然疫源性疾病。出血熱病毒主要分布在絲狀病毒科 (Filoviridae)、沙粒病毒科（Arenaviridae)、布尼亞病毒科（Bunyaviridae)和黃病毒科 (Flaviviridae)。可引發出血熱的病毒種類繁多，其中在全球范圍內影響較大的包括：絲狀 病毒科埃博拉病毒、馬爾堡病毒、沙粒病毒科拉沙病毒、鳩寧病毒、馬秋波病毒、布尼亞病毒 科裂谷熱病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒、漢坦病毒、發熱伴血小板減少綜合征病毒、黃 病毒科登革病毒、黃熱病毒、披膜病毒科基孔肯雅病毒等。該類疾病發病初期的臨床表現并 不特異，類似流感、瘧疾，常可發展到皮下、體腔和內臟出血，隨之而來的是休克、昏迷和神 經功能障礙等，病死率高，危害嚴重。
[0003] 出血熱病毒宿主和媒介類型廣泛，傳播方式多種多樣，隨著經濟全球化的進展，各 地區商貿往來和人員交流更加快捷頻繁，宿主和媒介分布的地理界線被打破，從而導致疫 情流行范圍的擴大和突然暴發，也增加了發生輸入性疫情的可能。2014年西非暴發的埃博 拉出血熱是由埃博拉病毒引起的急性出血性傳染病，自2014年3月報告出現首批病例到 12月24日共有19497人疑似或確認感染，導致7588人死亡，是1976年首次發現埃博拉病 毒以來發生的最大且最復雜的埃博拉疫情，本次疫情出現的病例和死亡數字超過了所有其 它疫情的總和。WHO已將埃博拉病毒列為對人類危害最嚴重的病毒之一，其平均病死率約 為50 %，在以往疫情中出現的病死率從25 %到90 %不等，目前發現有五個亞型，其中扎伊 爾型和蘇丹型病死率最高，分別可達88. 8%和53. 2%。2014年中國廣東暴發登革熱，至12 月1日廣東累計報告登革熱病例45053例。據估計，全球每年實際感染登革病毒的病例高 達3. 9億，其中超過2萬人因嚴重感染而死亡。不僅既往發現的病毒疫情不時暴發，引起新 發傳染病的新病毒也不斷被發現。2010年我國發現具有重要公共衛生意義的新型布尼亞 病毒--發熱伴血小板減少綜合征病毒（SevereFeverwithThrombocytopeniaSyndrome Virus，SFTSV)，該病毒感染人體引起的發熱伴血小板減少綜合征，是一種以發熱伴白細胞、 血小板減少和多臟器功能損傷為主要臨床表現的新發傳染病，死亡率高達30%。目前已在 山東、湖北、浙江、江蘇等多個省市發現SFTSV感染病例，2011-2013年，美國密蘇里州、日 本、韓國也相繼報道發現有經蜱蟲叮咬傳播的類似SFTSV病毒感染病例，SFTSV感染已逐漸 成為全球性的重要公共衛生問題。
[0004] 由于病毒性出血熱病死率高，傳播途徑廣，極易造成社會恐慌，美國疾病預防控制 中心將出血熱病毒列為一類生物武器，因此病毒性出血熱的防控和治療手段顯得尤為重 要。但目前已商業化的出血熱疫苗只有腎綜合征出血熱疫苗和黃熱病疫苗，另外尚有阿根 廷出血熱疫苗和裂谷熱疫苗處于臨床試驗階段；在藥物治療方面，尚無針對病毒性出血熱 的特效藥物。"診"、"防"、"治"三個環節構成了完整的疾病預防控制鏈，其中"診"不僅是其 中不可缺少的關鍵一環，而且也是有效防治的如提。在病毒性出血熱的尚發和臨床治療手 段的缺乏情況下，準確有效的診斷病原體顯得尤為重要。
[0005] 由于多數感染者早期缺乏特異的臨床表現，且不同的病毒性出血熱之間或者病毒 性出血熱與其他疾病（例如瘧疾、流感等）之間都存在相似的臨床癥狀，必須依賴實驗室 診斷方法加以確認。目前常用的出血熱病原體實驗室檢測方法主要包括病毒分離、聚合酶 鏈反應法（PCR)、酶聯免疫吸附法（ELISA)、間接免疫熒光法（IFA)、電鏡技術（EM)和免疫 組化技術。上述方法都有各自的優缺點，有的方法操作復雜，耗時費力；有的方法特異性和 /或敏感性較低；有的方法樣本用量過多；且上述方法均存在檢測通量不足，檢測范圍有限 的問題。
[0006] 基因芯片（Genechip)又稱為DNA芯片（DNAchip)、DNA微陣列（DNA microarray)，是生物芯片的一種，也是生物芯片技術中發展最成熟、最先進入應用和實現 商品化的技術。基因芯片技術是指直接將DNA探針或者在固相支持物（如玻片、硅片、尼龍 膜等）上原位合成寡核苷酸固定于支持物表面，然后與待分析的標記樣品雜交，標記的樣 品通過于基因芯片上已知堿基序列的DNA片段互補雜交，從而得到樣品的遺傳信息，確定 樣品的核酸序列，或對基因表達量及其特性進行分析。基因芯片技術因其具有快速、準確、 高通量、高效率、低成本等特點被廣泛應用于表達譜分析、單核苷酸多態性分析、疾病診斷、 病原微生物檢測等方面。
[0007] 本研究結合出血熱診斷的實際需要，選取了十三種出血熱相關病毒，并加入可引 起相似癥狀的瘧原蟲及流感病毒，旨在研制出血熱相關病原體鑒別基因芯片。基于化學發 光檢測方法，同時檢測十六種出血熱相關病原體，包括扎伊爾型埃博拉病毒、蘇丹型埃博拉 病毒、馬爾堡病毒、拉沙病毒、鳩寧病毒、馬秋波病毒、裂谷熱病毒、克里米亞 -剛果出血熱 病毒、瘧原蟲、漢坦病毒、發熱伴血小板減少綜合征病毒、登革病毒、黃熱病毒、基孔肯雅病 毒、A型流感病毒、B型流感病毒。該芯片法特異性高，敏感性強，適合于多種致發熱病癥病 原體的快速鑒定。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供一種基因芯片，該芯片可同時檢測十六種出血熱相關病原 體，包括扎伊爾型埃博拉病毒、蘇丹型埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙病毒、鳩寧病毒、馬秋 波病毒、裂谷熱病毒、克里米亞 -剛果出血熱病毒、癥原蟲、漢坦病毒、發熱伴血小板減少綜 合征病毒、登革病毒、黃熱病毒、基孔肯雅病毒、A型流感病毒、B型流感病毒，具有快速、準 確、高通量、高靈敏度的特點，可為出血熱病原的診斷、衛生監督及傳染病防控提供一種新 的技術手段。
[0009] 本發明所述的基因芯片其制備方法包括如下步驟：
[0010] 1?制備特異性引物
[0011] 經過比對各病原體基因組，選擇特異、保守片段作為檢測靶基因，在保證各病原體 靶基因特異性擴增的前提下兼顧其靈敏度，故將病原體特異性引物進行多重分管組合，經 優化最終確定了 3管多重TR-PCR體系。優選的29條特異性引物及其對應的擴增靶病原種 類和分管組合情況如表1所示，各下游引物5'端標記生物素。
[0012] 表1出血熱相關病原體引物及其對應的擴增靶病原種類和分管組合情況
[0013]
[0015] 2?制備特異性探針
[0016] 本著型間保守、屬間特異的原則，根據16種相關病原體靶基因序列間的比對，在 上下游引物范圍內的序列相對特異區進行特異性探針的設計。每種靶病原對應一條特異性 寡核苷酸探針，優選的特異性探針序列如表2所示，每條探針的3'端加入12個堿基T并在 3'末端以氨基修飾。
[0017] 表2特異性探針序列及對應的靶病原
[0018]
[0019] 3.制備基因芯片
[0020] 一個優選的實施方案，步驟2中各個寡核苷酸探針在點樣時，用芯片點樣液 (6XSSC，5 %甘油，0. 1 %SDS)稀釋至終濃度50yM。用市售的基因芯片點樣儀以接觸式 點樣方式將探針點到空白的醛基化修飾玻片上（陣列如表3所示），各探針的點樣量均為 3nl，其中質控探針為20T序列，5'端生物素標記、3'端氨基修飾，用來監測醛基片片基質 量。點制過程保持一定濕度，寡核苷酸芯片制備完畢后，芯片應至少在室溫干燥放置24小 時，使探針與載體充分交聯。
[0021] 表3寡核苷酸探針陣列
[0023] 4.建立RT-PCR體系
[0024] 本發明基因芯片中RT-PCR體系的特征為不對稱多重RT-PCR反應體系。合適的 RT-PCR體系可以進一步提高芯片的檢測靈敏度。對標記引物和非標記引物的絕對濃度和相 對比例、酶的用量等因素進行了優化。優選的RT-PCR體系及擴增條件，如表4所示：
[0025] 表4-1不對稱多重RT-PCR體系配方
[0029] 5?建立芯片雜交體系
[0030] 合適的雜交體系對芯片的特異性及靈敏度改善也有很大的促進作用。通過優化得 到了同時可以保證特異性和靈敏度的預洗液及雜交液成分、雜交條件和雜交后洗滌條件。 基因芯片雜交前分別置于預洗液（0.2%SDS)與去離子水中清洗20s，RT-PCR產物在95°C 變性5min后立即置于冰水浴中。將RT-PCR產物與雜交液等體積混合，優選的雜交液各組 分為8XSSC，10%甲酰胺，1.2%SDS，10XDenhardt's。優選的雜交條件為45°C水浴雜交 1小時。優選的洗滌條件為分別在洗液A(1XSSC，0. 2%SDS)，洗液B(0. 2XSSC)和洗液 C(0?IXSSC)中各洗滌 20s。
[0031] 6?建立信號檢測方法
[0032]將標記液（Str印tavidin-HRP)用稀釋液（1XPBS+0. 1%BSA)以 1 : 1000 稀釋， 于每個雜交區加入15y1，芯片置于37°C孵育30min。取出后用PBST洗液（1XPBS+0. 05% Tween-20)清洗20s，晾干。將化學發光HRP底物A液和B液（Millipore公司）等體積混 勻，每個雜交區加入20y1并迅速展開鋪勻，立即置于化學發光成像儀中掃描。記錄結果， 根據信號強度對結果進行判定。
[0033] 以上制備的出血熱相關病原體鑒別基因芯片包括寡核苷酸芯片、RT-PCR體系、雜 交液、洗液A、洗液B、洗液C、Str印tavidin-HRP、稀釋液、PBST洗液、化學發光HRP底物A液 和B液。
[0034] 本發明建立了一種基于化學發光技術平臺的基因芯片，可以對16種出血熱相關 病原體進行區分，包括扎伊爾型埃博拉病毒、蘇丹型埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙病毒、鳩 寧病毒、馬秋波病毒、裂谷熱病毒、克里米亞 -剛果出血熱病毒、癥原蟲、漢坦病毒、發熱伴 血小板減少綜合征病毒、登革病毒、黃熱病毒、基孔肯雅病毒、A型流感病毒、B型流感病毒。 該基因芯片和相應的制備方法，具有較強的實用性，通過一次實驗操作實現多個病種的檢 測，在縮短檢測周期的同時提高檢測效率。與常規培養方法比較，具有快速、準確、靈敏的優 勢，與免疫學方法和其他核酸檢測方法相比，具有高通量、高特異性的優點，可為出血熱病 原的診斷、衛生監督及傳染病防控提供一種新的技術手段。
【附圖說明】
[0035] 圖1:基因芯片外觀示意圖，每張芯片上有10個相同的分布有探針點陣的雜交反 應區。
[0036] 圖2 :出血熱相關病原體鑒別基因芯片探針點陣布局圖，其中Ia至8a為質控點； Ib至Id為扎伊爾型埃博拉病毒探針；2b至